APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS DE PCR E SUAS TÉCNICAS DERIVADAS EM DIAGNÓSTICO MOLECULAR

Artigo: APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS DE PCR E SUAS TÉCNICAS DERIVADAS EM DIAGNÓSTICO MOLECULAR – UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS.

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DIAGNÓSTICO DO PROTOZOÁRIO Trypanosoma cruzi

O diagnóstico da doença de Chagas pode ser realizado por meio de diferentes estratégias, dependendo da fase em que a doença se encontra. No estágio inicial da infecção pelo Trypanosoma cruzi um grande número de parasitos circula na corrente sanguínea e o diagnóstico pode ser obtido por meio de exame microscópico direto no sangue periférico. Em contraste, na fase crônica os níveis de parasitas se encontram abaixo dos limites de detecção por microscopia e, assim, o diagnóstico se baseia, sobretudo, na detecção da resposta sorológica do hospedeiro ou na amplificação in vitro da população de parasitos por meio dos métodos de xenodiagnóstico ou hemocultivo. Embora altamente específico, o xenodiagnóstico possui uma sensibilidade limitada, detectando o parasito em apenas 20% a 60% dos pacientes crônicos soropositivos, dependendo da área endêmica em estudo e, consequentemente, gerando um número significativo de resultados falso-negativos (BRITO, 2005). A hemocultura não tem sido usada com frequência no diagnóstico, devido também a sua baixa positividade na fase crônica da infecção. Além disso, ambos os ensaios de amplificação biológica podem selecionar subpopulações de parasitos, levando a uma distorção dos resultados de tipagem do agente etiológico envolvido e dos dados epidemiológicos gerados (MARCON, 2001).

As limitações na sensibilidade e especificidade dos testes laboratoriais parasitológicos e sorológicos, especialmente quando se trata do diagnóstico de fase crônica, explicam o interesse e a necessidade de implantação de um método direto e mais sensível que permita monitorar a presença do parasito e confirmar a etiologia da doença. Neste sentido, a principal técnica que tem sido testada para a pesquisa do parasita, T. cruzi, diretamente no sangue de pacientes crônicos é o ensaio molecular por PCR, baseado no emprego de oligonucleotídeos sintéticos que amplificam sequências de DNA específicas de T. cruzi (MARCON, 2001).

Os estudos de biologia molecular estão sendo empregados tanto em testes confirmatórios para doença de Chagas, bem como, para o acompanhamento do paciente chagásico crônico. São vários os iniciadores registrados no GenBank que poderiam ser utilizados como base para as reações de PCR (GILBER, 2007).

Baseando-se na técnica de PCR, é feita à amplificação de fragmentos oriundos do DNA genômico de T. cruzi ou do DNA de mini círculos do cinetoplasto do parasito (k-DNA). Este é um procedimento a ser empregado em amostras de sangue de pacientes chagásicos e/ou fezes de triatomíneos, ou em outros materiais biológicos, detectando-se o DNA de um único parasita ou frações do mesmo, com ausência de reações cruzadas. Em estudos de monitoramento terapêutico com testes periódicos e sistemáticos dos indivíduos, recomenda-se a utilização de técnica molecular associada à sorologia (GILBER, 2007).

A reação de PCR constitui-se em um instrumento diagnóstico valioso, notadamente no caso de doenças infecciosas graves, devido à sua capacidade em detectar agentes