AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA

AULA PRÁTICA: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE DA ENZIMA AMILASE SALIVAR – EFEITO DO TEMPO DE INCUBAÇÃO

DISCIPLINA: BIOQUÍMICA

Profa. MSc: Raquel Spadotto

Derick William

Irmo Guiseppe

Alisson Felipe

Capão Bonito - SP

Outubro/2013

INTRODUÇÃO

A atividade enzimática pode ser avaliada medindo-se a velocidade de consumo do substrato ou a velocidade de aparecimento do produto. Esta atividade depende de vários fatores, tais como o tempo de reação, a concentração da enzima, a concentração do substrato, a temperatura, o PH do meio e a presença de cofatores e/ou inibidores. Para exemplificar estes conceitos, nesta aula prática será avaliada a atividade da amilase salivar.

A amilase é encontrada nos animais (sangue, saliva e suco pancreático), plantas, fungos e bactérias. Esta enzima hidrolisa as ligações glicosídicas do amido, glicogênio, poli e oligossacarídeos ao acaso. Como resultado da ação não ordenada da amilase salivar, obtém-se rapidamente uma mistura complexa de produtos de hidrólise que incluem: amido solúvel, maltodextrinas, maltoses, e, eventualmente, glicose. Na boca, a amilase salivar tem participação na digestão de carboidratos.

OBJETIVO

Avaliar a atividade da enzima amilase salivar e analisar o efeito do tempo de incubação da mesma.

MATERIAIS E REAGENTES

o Becker;

o Tubo de ensaio;

o Estante para tubo de ensaio;

o Pipeta graduada;

o Solução tampão;

o Lugol;

o Saliva.

PROCEDIMENTO

A) Coleta da saliva;

- Coletamos 1,0mL de saliva e diluímos na proporção 1:4 com tampão fosfato pH 6,8 (1,0mL de saliva + 3,0mL de tampão);

- Reservamos a saliva diluída para ser utilizada em etapas posteriores.

B) Caracterização padrões de hidrólise total e não hidrólise do amido;

- Identificamos 2 tubos de ensaio e procedemos conforme esquema abaixo:

Tubo A (Padrão de não hidrólise) 2,0 mL de amido 2 gts de Reativo de Lugol

Tubo B (Padrão de hidrólise total) 2,0mL de glicose 2 gts de Reativo de Lugol

- Homogeneizamos e observamos;

- Coloração azul-arroxeada evidenciou a formação de complexo iodo com o polissacarídeo amido, caracterizando um padrão indicativo de que não ocorreu hidrólise do amido;

- Coloração amarela caracterizou a hidrólise total do amido;

- Reservamos os tubos para comparar com a análise do experimento da avaliação do efeito do tempo de incubação na atividade enzimática.

C) Avaliação do efeito do tempo de incubação na atividade enzimática;

- Numeramos 6 tubos de ensaio e procedemos conforme o esquema abaixo, adicionando 2gts do Reativo de Lugol após o tempo especificado de incubação a 37°C.

Tubo 1 – 2mL de amido 2,0mL de tampão fosfato pH 6,8 500μL saliva diluída 2 minutos a 37°C

Tubo 2 – 2mL de amido 2,0mL de tampão fosfato pH 6,8 500μL saliva diluída 5 minutos a 37°C

Tubo 3 – 2mL de amido 2,0mL de tampão fosfato pH 6,8 500μL saliva diluída 10 minutos a 37°C

Tubo 4 – 2mL de amido 2,0mL de tampão fosfato pH 6,8 500μL saliva diluída 15 minutos