Analise Bioquimica

ANALISE BIOQUÍMICA DAS ENZIMAS β-GLICOSIDASE E QUITOTRIOSIDASE EM SANGUE IMPREGNADO EM PAPEL FILTRO EM DIFERENTES CONDIÇÕES CLÍNICAS.

Materiais e métodos utilizados:

Foram coletadas amostras de sangue total para obtenção de SIPF, plasma e leucócitos. 30 amostras, mostram indivíduos saudáveis entre 18 e 50 anos de idade de ambos os sexos, 8 pacientes foram diagnosticados com DG 5 do gênero feminino e 3 do masculino entre 11 e 43 anos.

O grupo de heterozigotos foi constituído por 6 indivíduos que apresentavam apenas um alelo mutante confirmado por analise molecular.

Coleta e armazenamento das amostras:

Para os ensaios enzimáticos nas amostras foram coletados 10ml de sangue venoso em uma seringa e colocado em um tubo com heparina. Uma alíquota de 2 ml foi separada para separar o plasma e fazer a impregnação no papel filtro. Sendo destinadas para separação de plasma e leucócitos foram armazenadas a -20°c e o SIPF foi armazenado a 4°c ate o momento do ensaio enzimáticos.

Separação de leucócitos:

Os leucócitos foram isolados de sangue heparinizado de acordo com o método descrito por Skoog e Beck ( 1956 ) , que consiste em transferir 10 mL de sangue total para um tubo de vidro grande e adição de 10 mL de uma solução composta pela mistura dos seguintes reagentes : solução de ácido cítrico-citrato-dextrose ( ACD ) , dextran 6% e glicose 5% , diluídos em cloreto de sódio 0 , 9 % .

Após a centrifugação , o sobrenadante foi descartado e o precipitado , contendo os leucócitos foi lavado com 0.8 mL de solução de NaCl 0,9%, homogeneizando em agitador tipo vórtex.

Depois de 90 segundos foi adicionado 0 , 8 mL de NaCl 3 , 6% , misturado por inversão e centrifugado a 3000 rpm por 5 min a 4ºC.

Dosagem de proteínas

No momento da análise , o pellet de leucócitos foi diluído em água destilada , em um volume que variou de 300 a 600 μL .

- Depois as amostras foram sonicadas em Sonicador Ultrassônico , por 2 ciclos de 25 segundos , intercalados por um período de descanso de 30 segundos , a fim de assegurar o rompimento das membranas celulares e a conseqüente liberação do material celular contido no interior dos lisossomos .

As amostras foram diluídas em água destilada ( 20 μL de amostra e 480 de água destilada ) .

Ensaios enzimáticos: Leucócitos

β-Galactosidase (Enzima de referência)

Para o ensaio enzimático da β-galactosidase ( β-gal ) em leucócitos ( enzima de referência ) foi utilizado o método descrito por Suzuki , K.

O substrato 4-metilumberiferil-β-D-galactosídeo foi diluído em tampão citrato-fosfato pH 4 , numa proporção de 1 mg / 1 , 5 mL , que foi dissolvido através de aquecimento .

No ensaio , foi utilizado um volume de 100 μL de amostra diluída e 200 μL de substrato , em tubos de vidro que foram incubados por 1 hora , a 37 ºC , com agitação suave.

β-Glicosidase :

A atividade enzimática da β-glicosidase foi determinada de acordo com Peters e colaboradores ( 1976 ) , utilizando-se uma mistura de 10 mmol/L de 4-metilumbeliferil-β-D-glicosídio como substrato e 50 mmol/L de tauracolato de sódio como detergente .

Para o ensaio foram utilizados 20 μL de leucócitos , 100 μL de substrato e 50 μL de tampão citrato-fosfato 0.54 mol/L pH 5,5.

A reação foi interrompida pela adição de 1500 μL de tampão glicina-NaOH 0 , 5 mol/L pH 10 , 3 , e a fluorescência foi medida em um espectrofluorímetro Spectra Max M2 usando filtros de emissão e excitação de comprimentos de onda 450 nm e 365 nm , respectivamente .

Ensaios enzimáticos: Plasma

Quitotriosidase

A atividade enzimática da quitotriosidase foi determinada segundo Hollak e colaboradores ( 1994 ) , utilizando-se o substrato artificial 4-metilumbeliferil-β-D-N-N'-N”-triacetilquitotriosísio 0 , 02 mmol/L .

O material destinado ao ensaio continha 5 μL de plasma acidificado ( 50 μL de plasma adicionado de 5 μL de ácido cítrico 0 , 2 mol/L ) e 100 μL de substrato , dissolvido em tampão citrato 10mmol/L-fosfato 200 mmol/L pH 5 , 2 em um volume total de 105 μL .

reação foi interrompida com 1000 μL de tampão glicina-NaOH 0 , 5 mmol/L pH 10 , 3 , e a fluorescência foi lida com um espectrofluorímetro Spectra Max M2 com filtros de emissão e excitação de 450nm e 365nm , respectivamente .

Ensaios enzimáticos: SIPF

As amostras de SIPF foram obtidas de sangue total , utilizando-se papel Whatman nº 903 , secas à temperatura ambiente , por um período de 4 horas , em superfície plana .

Depois de secas , as mesmas foram acondicionadas em sacos plásticos e armazenadas a 4 ºC até o momento da análise .

β-Glicosidase

No ensaio foram utilizados discos de 3 , 0 mm de diâmetro , contendo SIPF ( ~ 3 , 6 μL de sangue total ) , em tubo eppendorf de 2 , 0 mL .

Para o ensaio foram utilizados 100 μL de substrato e 50 μL de tampão citrato-fosfato 0 , 54 mol/L pH 5 , 5 e incubados a