Clonagem De DNA

A clonagem molecular é o processo de construção de moléculas de DNA recombinante e da sua propagação em hospedeiros apropriados que possibilitam a seleção do DNA recombinante. Esta tecnologia permite estudar os genes e os seus produtos, obter organismos transgênicos e realizar terapia gênica.

A clonagem molecular compreende pelo menos dois estágios importantes. Primeiro, o fragmento do DNA de interesse chamado de inserto é ligado à outra molécula de DNA chamada de vetor para formar o que se chama de DNA recombinante. Segundo, a molécula do DNA recombinante é introduzida numa célula hospedeira compatível, num processo chamado de transformação. A célula hospedeira que adquiriu a molécula do DNA recombinante é agora chamada de transformante ou célula transformada.

Um único transformante, em condições ideais, sofre muitos ciclos de divisão celular, produzindo uma colônia que contém milhares de cópias do DNA recombinante.

O resultado é a amplificação seletiva de um gene ou segmento de DNA particular. A clonagem de DNA de qualquer organismo envolve alguns procedimentos gerais, como:

 Extração e Isolamento do DNA

 Corte do DNA em locais precisos, com auxilio de endonucleases que reconhecem sequencias específicas de DNA (Endonucleases de Restrição) fornecem as tesouras moleculares.

 Seleção de uma molécula pequena de DNA capaz de autorreplicação. Estes DNAs são chamados de vetores de clonagem (agente de distribuição). Eles são plasmídeos metabólicos ou DNAs virais.

 Ligação covalente dos dois fragmentos do DNA. A enzima de ligação DNA-ligase liga ao vetor de clonagem e o DNA a ser clonado. Estes ligados formam o DNA recombinante.

 Passagem do DNA recombinante do tubo de ensaio para célula hospedeira que irá fornecer a maquinaria enzimática para a replicação do DNA;

 Seleção ou identificação das células hospedeira que contenham o DNA recombinante.

FIGURA 1. Esquema Geral da Clonagem de DNA.

FONTE: Google Images.

Enzimas para a manipulação de DNA

As enzimas modificadoras de DNA são as principais ferramentas da engenharia genética e possibilitam a manipulação in vitro de moléculas de DNA ou RNA. A tecnologia do DNA recombinante é possível devido a descoberta das enzimas bacterianas que catalisam reações específicas nas moléculas de DNA. As enzimas podem ser agrupadas em cinco classes (AUSUBEL, et al., 2003; TORRES, 2003).

Nucleases e ribonucleases - clivam a ligação fosfodiéster do DNA e RNA, respectivamente, e podem ter atividade exonucleásica 3' - 5' e/ou 5' - 3' ou endonucleásica. Dentre as nucleases, destacam-se as endonucleases de restrição, comumente chamadas de enzimas de restrição, que são importantes para a tecnologia do DNA recombinante. Elas clivam seqüências de DNA específicas em ambas as fitas, chamadas de sítios de restrição, e podem gerar extremidades abruptas ou coesivas (Tabela 1).

Tabela 1. Exemplos de endonucleases de restrição com os organismos de origem e as sequencias de reconhecimento. As setas indicam os sítios de clivagem (NASCIMENTO et al, 1999).

FONTE: Conceitos Básicos de Técnicas em Biologia Molecular, por Liziane Maria de Lima. Campina Grande, 2008

Esse sítio de reconhecimento da enzima é normalmente uma sequencia palindrômica, ou seja, a sequencia de bases de uma fita é a mesma da fita complementar, quando lida na direção contrária. As enzimas de restrição são nomeadas conforme o microrganismo do qual foram isoladas; a primeira letra representa o gênero, as segunda e terceira letras representam a espécie, as seguintes, geralmente, representam a linhagem e a ordem da descoberta.

Ligases - catalisam a formação de uma ligação fosfodiéster entre grupos 3'- OH e 5'-PO4-, unindo covalentemente moléculas de DNA de fita dupla, resultando em uma molécula de DNA recombinante.

Polimerases - catalisam a síntese de moléculas de DNA a partir de um molde, ou seja, sintetiza uma nova fita de DNA, complementar a um molde de DNA ou RNA preexistente. As polimerases são DNA ou RNA-dependentes e são essenciais para a replicação e manutenção de todos os organismos.

Modificadoras - catalisam reações que modificam moléculas de DNA pela remoção ou adição de grupos químicos específicos, como a remoção ou adição de grupamentos fosfato das extremidades 5'.

Figura 1. Os dois tipos de clivagem feitos por enzimas de restrição. As setas indicam os sítios de clivagem e as linhas pontilhadas representam o centro de simetria da sequência.

Fonte: Instituto Superior de Ciências da Saúde – Norte

Plasmídeos ou vetores

Os plasmídeos são moléculas de DNA fita dupla extra cromossomal encontrados em todas as espécies de bactérias. Os plasmídeos variam em estrutura, tamanho, modo de replicação, número de cópias por célula e habilidade para propagarem-se em diferentes bactérias. Todos contêm três características comuns: marca seletiva, origem de replicação e sítio múltiplo de clonagem (NASCIMENTO, 1999).

A marca seletiva refere-se a genes que conferem resistência a antibióticos e que proporcionam a seleção dos clones transformados daqueles não transformados. Para essa seleção, é adicionado ao meio de cultura o antibiótico adequado, em concentrações que permitam diferenciar a célula não-transformada (sensível ao antibiótico) da célula transformada (resistente ao antibiótico). Os principais antibióticos utilizados nos meios de cultura para a seleção de transformantes estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Principais antibióticos utilizados como agentes seletivos e a concentração final utilizada.

FONTE: Conceitos Básicos de Técnicas em Biologia Molecular, por Liziane Maria de Lima. Campina Grande, 2008

A origem de replicação autônoma ou ori é o sítio em que se inicia a replicação do DNA, podendo se replicar independentemente da replicação bacteriana e produzir milhares de cópias do plasmídeo dentro da célula hospedeira. A replicação dos plasmídeos pode ser sincronizada com o ciclo celular, resultando em baixo número de cópias, ou ser independente do ciclo da célula hospedeira, permitindo a proliferação de centenas de cópias