Cultivo De Bacterias

CULTIVO DE MICRORGANISMOS EM LABORATÓRIO

1. INOCULAÇÃO E ISOLAMENTO

1.1 INOCULAÇÃO

Semear ou inocular significa introduzir artificialmente uma quantidade de amostra (inoculo) em um meio de cultura adequado, com a finalidade de iniciar um cultivo microbiano. Após a inoculação, o meio de cultura é incubado a uma temperatura adequada para o crescimento.

A inoculação pode ser realizada em meio líquido, sólido ou semi-sólido, utilizando-se uma alça ou pipeta estéril.

Cultivo em meio líquido

Habitualmente se realiza em tubos ou em frascos de laboratório (erlenmeyers, p. ex.). O crescimento da população microbiana é evidenciado pela turvação do meio, por formação de película ou por formação de sedimento.

Fig. 1 Tubo à direita, meio BHI sem semeadura; tubo à esquerda, meio BHI após crescimento bacteriano. Observar turvação indicativa de multiplicação microbiana.

Cultivo em meio sólido

Pode ser conduzido em tubos ou em placas.

a) Tubos com ágar inclinado – Para inoculação, move-se suavemente a ponta da alça sobre a superficie do ágar com um movimento em zig-zag do fundo até a parte superior, com cuidado para não danificar (ferir) a superfície do meio.

b) Tubos com ágar não inclinado – Inocula-se introduzindo a ponta de uma alça em agulha no centro do meio.

c) Inoculação em placas de Petri – Pode ser em superficie ou em profundidade.

A inoculação em superfície pode ser realizada de duas formas:

1) Adiciona-se 0.1 mL de uma diluição da amostra com pipeta estéril no centro da placa e espalha-se com o auxílio de uma alça de Drigalski estéril.

2) Inocula-se com a alça de platina, conforme será explicado mais adiante. No item técnica de semeadura.

Inoculação em profundidade: Adiciona-se 1 mL da amostra ou uma de suas diluições no centro de uma placa de Petri vazia. Verter sobre o inóculo 20 mL de meio de cultura fundido e aquecido a 45ºC. Agitar a placa realizando movimentos circulares no sentido horário e no sentido anti-horário ou realizando movimentos em oito.

Incubar as placas na posição invertida, uma vez que a elevada concentração de água no meio pode provocar condensação durante a incubação.

No meio sólido, cada célula viável dará origem a uma colônia, portanto a inoculação em placas pode ser utilizada, não somente para cultivar microrganismos, como também para contar e isolar. Em geral quando se deseja obter colônias isoladas a partir de um determinado material, é necessário diluir a amostra em tubos com água destilada estéril.

TÉCNICA DE SEMEADURA

Alguns procedimentos são indispensáveis para detecção e quantificação de diferentes microrganismos. Estas técnicas consistem de regras de assepsia e segurança para evitar a contaminação dos meios de cultura com microrganismos do ambiente; para obter culturas puras; para evitar acidentes laboratoriais.

1. A alça de platina deve ser flambada antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto, devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama de 2 a 3 vezes. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45 em relação à mesa de trabalho.

2. Antes de retirar o material para a elaboração do esfregaço ou para semeadura deve-se esfriar a alça na parede interna do tubo ou na tampa da placa de Petri.

3. Para a semeadura em tubos de ensaio, deve-se flambar rapidamente a boca dos mesmos logo após a retirada do tampão de algodão. Este deverá ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão que está segurando a alça. Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo e recolocar o tampão de algodão. Flambar a alça após o uso. Não pousar os tampões sobre a bancada.

4. As pipetas utilizadas em Microbiologia são previamente embrulhadas em papel e esterilizadas. Para uso, torcer o papel na região central da pipeta, retirar primeiramente o papel na parte superior e depois a inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta seqüência evita que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Uma vez usada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba de vidro ou plástico, contendo desinfetante.

5. As placas de Petri deverão ser abertas próxima ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com tampa voltada para baixo.

Técnica de semeadura em placa de Petri a partir de cultura de bactéria.

Procedimento:

a.) flambar a alça;

b.) remover o tampão de algodão;

c.) introduzir a alça na cultura de bactéria;

d.) com a alça, delicadamente, semear na placa de Petri;

e.) flambar novamente a alça;

f.) a partir de um ponto já semeado, distribuir o material na placa, fazendo estrias no restante da placa.

1.2. ISOLAMENTO

Isolar significa separar um tipo de microorganismo a partir de uma população que o contém. Em habitats naturais, raramente encontramos os microrganismos em cultura pura (um único tipo de microrganismo), portanto faz-se necessário um procedimento de isolamento para separar e identificar os distintos tipos de microrganismos presentes.

O isolamento pode ser feito diretamente a partir de uma amostra quando os microorganismos estão numa proporção adequada. Quando o microrganismo que se deseja isolar se encontra em pequena quantidade, é realizado o procedimento