Diagnósticos Utilizando A técnica De FISH

DIAGNÓSTICOS UTILIZANDO A TÉCNICA DE FISH

Hibridização fluorescente in situ (FISH) é um método histoquímico que permite a visualização, identificação, enumeração e localização simultânea de micro-organismos in situ, sem a necessidade de cultivos celulares. É um método que consiste na visualização direta em microscópios óticos epifluorescentes em cortes histológicos. Também permite que sequências de ácidos nucleicos sejam examinadas no interior de células sem alterar sua morfologia ou integridade de seus compartimentos. Com isso há combinação da precisão genética molecular com a informação visual do microscópio.

No procedimento histoquímico da FISH, o princípio básico é o anelamento da sonda com a sequência alvo, para a visualização em microscópio epifluorescente. Entende-se por sonda, uma sequência de oligonucleotídeos complementares e específicos marcados com substâncias fluorescentes os quais se anelarão ao alvo. Há duas possíveis marcações das sondas, a direta e a indireta.

De acordo com Botari et al. (2006), a FISH tem quatro procedimentos básicos:

1- Fixação e permeabilização da amostra, 2- hibridização, 3- lavagem para remoção das sondas em excesso e 4- detecção pela microscopia fluorescente. Antes da hibridização, as amostras contendo os micro-organismos são fixadas para proteger o RNA da degradação de RNAses endógenas e permeabilizadas para permitir que as sondas penetrem na célula.

A maioria das aplicações da FISH tem como alvo o RNA ribossomal. A utilização deste alvo justifica-se primeiramente por todas as células necessitarem de ribossomos para a translação, portanto, podem estar presentes em todas as células vivas. A segunda razão é a sequência do rRNA ser evolutivamente conservada em relação a outras sequências de genes dentro de uma mesma espécie, não sendo possível desenhar uma sonda para identificar grandes domínios taxonômicos como filos, classes ou ordens. A terceira e última razão é, como cada célula contém muitos ribossomos, esse alvo é naturalmente amplificado podendo atingir um número de 100.000 cópias por célula.

A FISH tem uma grande variedade de aplicações dentro de diferentes campos de investigação, incluindo análise de danos cromossomais, mapeamento genético, toxicologia molecular, genômica comparativa, biologia evolutiva, ecologia microbiana e diagnóstico de doenças.

APLICAÇÕES:

NEOPLASIAS

O estudo das alterações cromossômicas presentes nas neoplasias, principalmente hematológicas, tem grande importância no auxílio do diagnóstico, no prognóstico e na monitorização da doença. A técnica de FISH tem a vantagem de poder ser aplicada em diversos tipos de amostras e ser mais rápida porque não necessita de cultivo de células.

Por exemplo: A LMC caracteriza-se pela presença da translocação t(9;22) que dá origem ao cromossomo Philadelphia. A sua detecção é realizada, geralmente, em preparações de aspirado de medula óssea. Nesses casos a técnica de FISH é indicada, após a realização da citogenética tradicional, nos casos em que:

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