EXTRAÇÃO DE DNA E ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

INTRODUÇÃO

A unidade fundamental informacional nos organismos vivos é o gene, e este é definido bioquimicamente como um segmento de DNA capaz de codificar a informação requerida para a produção de um produto biológico funcional. As moléculas de DNA são as maiores macromoléculas nas células e se apresentam bastante sensíveis e suscetíveis a quebra por forças mecânicas de cisalhamento, o que torna o isolamento de moléculas intactas algo delicado. Moléculas de ácido desoxirribonucléico (DNA) são polímeros de nucleotídeos, que possuem três componentes característicos: uma das quatro bases nitrogenadas (adenina, guanina, timina ou citosina), uma pentose (desoxirribose), e um grupamento fosfato, de maneira a formar uma estrutura em hélice (NELSON e COX, 2006; LIMA e FRACETO, 2007).

Atualmente existem diferentes protocolos de extração de DNA para diferentes espécies, os quais de modo geral visam evitar problemas como a degradação do DNA por DNAses endógenas, co-isolamento de polissacarídeos que podem passar a inibir a ação de enzimas, co-isolamento de outros metabólicos que possam danificar o DNA ou até mesmo impedir ou prejudicar a ação de enzimas de restrição ou da Taq-Polimerase. O isolamento de ácidos nucléicos requer uma amostra de boa qualidade de modo a não inibir tratamentos enzimáticos e não ocorrer interferências na migração das moléculas durante a eletroforese em gel.

Para a quantificação e qualificação da amostra de DNA obtida, é comum a utilização do método de eletroforese, processo utilizado para a separação de moléculas de DNA, RNA e proteínas conforme sua carga elétrica e peso molecular. Essa técnica tira proveito do caráter negativo da molécula de DNA, negatividade característica à presença dos grupos fosfatos na molécula. A técnica de eletroforese em gel de agarose consiste na submissão do DNA a um campo elétrico, o qual deve ser colocado no lado negativo (sua carga característica), de maneira a migrarem ao pólo positivo. Moléculas menores tendem a correr mais do que moléculas maiores, e a concentração da agarose também influencia na separação das mesmas.

A agarose é um polissacarídeo composto por subunidades de galactose e galactopiranose, que se solubiliza em água fervente e geleifica após esfriar, como uma gelatina. É uma matriz inerte usada como suporte na visualização de DNA.

APLICAÇÕES

Uma amostra de DNA extraída pode ser analisada e utilizada em testes genéticos, no pré-diagnóstico de futuras doenças que podem se manifestar, na identificação/investigação de um corpo de delito e de análises forenses. Pode também ser utilizada para Reação de Polimerização em Cadeia (PCR), seqüenciamento genético, transgenia entre outras aplicações.

MATERIAIS E MÉTODOS

 EXTRAÇÃO DE DNA

• Haste/Swab;

• Tubo Eppendorf;

• Micropipetas – Ponteiras;

• Solução de lise celular;

• Solução de sal concentrado;

• Etanol;

• Álcool Iso-Propílico;

• Tampão;

• Banho-maria;

• Centrífuga;

O procedimento consiste na coleta de células bucais para a extração de DNA. Para isso com a ajuda de uma haste (swab), faz-se a coleta da amostra das células bucais (raspagem da parte interna da bochecha). A ponta em que foi realizada a coleta deve ser cortada dentro do tubo de Eppendorf de modo que se consiga fechar o tubo. Utilizando a micropipeta, adiciona-se a solução de lise celular (contendo detergente SDS e proteinase K) e o tubo é levado ao banho-maria. O detergente rompe a membrana celular e nuclear liberando o DNA, que ainda encontra-se enovelado por proteínas chamadas histonas. As proteinases K são responsáveis pelo desenrolamento do DNA de histonas.

Após o banho-maria, retira-se a ponta do swab de dentro do Eppendorf. Nesse momento já ocorreu lise celular e temos o DNA exposto na solução. Adiciona-se então a solução de sal concentrado, que fará com que proteínas e outros restos celulares se aglutinem ao fundo. Centrifuga-se a amostra, e com a ajuda de uma micropipeta retira-se o sobrenadante que contém o DNA em solução, que é adicionado a um novo tubo. Proteínas, lipídeos, carboidratos e demais restos celulares se aglomeraram ao fundo do antigo tubo.

Adiciona-se álcool iso-propílico. O mesmo causará a precipitação do DNA. Leva-se a amostra à centrífuga, e então já podemos ver o DNA aderido ao fundo da parede do tubo de Eppendorf como um gelatinoso transparente. Descarta-se o sobrenadante, lava-se o pellet com um pouco de etanol e deixe-o secar.

Adiciona-se então o tampão, que ajudará na conservação das moléculas de DNA. Se bem armazenada, a amostra de DNA pode ser usada para estudo após anos.

 ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE

• Agarose em pó;

• Erlenmeyer;

• Molde para o gel;

• Pente para o gel;

• Cuba (Sistema Eletroforese);

• Microondas;

• Tampão;

• Tubo Eppendorf;

Após