Extração Dna Total E Plasmidial

LEVANTAMENTO TEÓRICO

Existem várias técnicas para extração do DNA, que utilizam diferentes metodologias e espécies biológicas. O sangue é muito utilizado para extração de DNA porque é fonte abundante de informação genética e por fornecer amostra fresca para análise (a maioria dos testes de DNA para o diagnóstico envolve a extração de DNA dos leucócitos humanos). No entanto, muitos outros materiais podem ser efetivamente analisados: células epiteliais da mucosa oral; unhas, pêlos e fios de cabelo (região do bulbo capilar); manchas de material biológico (líquido seminal, urina, saliva) em vidro, faca, têxtil; ossos carbonizados, ossadas ou dentes; material anatomopatológico; e inclusive células deixadas por impressão digital em selos, filtros de cigarro, copos, talheres e telefone.

Isso tem permitido a investigação de diferentes amostras biológicas mesmo quando o DNA está presente em pequenas quantidades. Vários campos da ciência são beneficiados com esse aperfeiçoamento, como a medicina forense, as investigações criminais, exclusão de paternidade, a busca de marcadores tumorais ou agentes infecciosos, e o transplante de medula identificando a pega do enxerto.

Em geral a extração consiste basicamente de quatro etapas:

1-Lise celular (com o objetivo de expor o DNA)

2-Remoção dos lipídeos da membrana celular (geralmente feita com detergente)

3- Remoção das proteínas celulares

4- Precipitação do DNA

A extração de DNA pode ser feita por sais, fenol, clorofórmio, resinas, kits, entre outros. Nessa prática será utilizado para extração o NaCl.

Em bactérias, além do DNA genômico, elas possuem múltiplas cópias de um pequeno DNA circular chamado DNA plasmidial, ou simplesmente plasmídeo. Eles são responsáveis por desempenhar diversas funções, que podem, por exemplo, permitir a sobrevivência da bactéria em condições extremas, e mais, possuem genes que codificam substâncias que irão causar a morte de outros microrganismos, inclusive bactérias, impedindo o crescimento destes no meio, isso é observado na natureza quando ocorre a competição por nutrientes.

O método mais utilizado para o isolamento e purificação de DNA de plasmídeo se baseia na lise alcalina, proposto originalmente por Birboim e Doly (1979). Esse método é muito robusto e apresenta bons resultados qualitativos e quantitativos sob diversas condições (isolados, meios de crescimento, etc.). Entretanto, o tamanho do plasmídeo não deve ser muito grande (<20 kb). O método de isolamento por lise alcalina baseia-sena diferença em desnaturação, em condições alcalinas (pH ~12) entre o DNA plasmidial e o cromossomal de alto peso molecular. Plasmídeos grandes apresentam propriedades mais próximas ao DNA cromossomal dificultando a separação entre eles.

A clonagem gênica permitiu um avanço no conhecimento de áreas biológicas. Clonagem é a obtenção de múltiplas cópias de um gene para que se possa manipulá-lo quimicamente. A clonagem biológica de um gene consiste em inserí-lo em um vetor, que é um DNA capaz de se multiplicar dentro de um sistema vivo. Um exemplo disso é o plasmídeo bacteriano. Sendo que uma colônia de bactérias é proveniente de uma só célula, ou seja, um clone, e cada bactéria carregam múltiplas cópias do plasmídeo que por sua vez carrega o gene clonado inserido em si, quando se faz extração de DNA plasmidial (MINIPREP), obtém-se um número suficiente de cópias desse gene para manipulações químicas (Labuto et.al., 2003).

COMPARAÇÃO DE MÉTODOS PARA EXTRAÇÃO DE DNA NA REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE PARA DETECÇÃO DE Salmonella enterica sorovar Enteritidis EM PRODUTOS AVÍCOLAS

Salmonelose é uma doença infecciosa provocada por um grupo de bactérias do gênero Salmonella. A reação em cadeia polimerase tem se mostrado um teste de diagnóstico eficiente para a detecção de vários microrganismos, inclusive a Salmonella.

O sucesso de uma PCR depende também da qualidade do DNA extraído, não podendo conter resíduos de substâncias, porque isso pode levar à diminuição da