Extração E Caracterização De Uma Enzima

1. Resumo

Foi necessário atenção no experimento, por mais que em algumas partes tenha sido simples. Foram realizados 5 procedimentos, onde utilizou-se a reação de biureto, reação de Heller, o teste de atividade da enzima, o efeito do calor e a especificidade da enzima. Preparou-se a solução de urease, em seguida foram separados os matérias necessário para realização do experimento. Lembrando que o procedimento 4 foi iniciado antes de todos, pois era necessário este está em banho Maria, para assim depois comparar com o procedimento 3. Foram observados e anotados os resultados.

2. Introdução

Enzimas são proteínas especificas para catalisar reações químicas, principalmente reações biológicas, elas aceleram significativamente as reações e não são consumidas nas mesmas. As enzimas são altamente especificas, interagindo com um ou alguns poucos substratos e catalisando apenas um tipo de reação química.

Essa especificidade é explicada pelo modelo de Emil Fischer, proposto em 1894, chamado modelo chave e fechadura. Para se considerar a ação catalítica de uma enzima é interessante considerar a grande diferença de tamanho entre a enzima e seu substrato. A enzima uréase, que catalisa a reação de hidrolise da uréia tem peso molecular aproximadamente de 500.000 dáltons, enquanto a uréia tem peso molecular de 60 e a água de 18. O investimento energético para a síntese de uma molécula tão grande justifica-se pela obtenção de uma estrutura muito precisa, com reentrâncias de forma apropriada e com grupos químicos localizados em posições exatas para servi a catálise.

A urease foi à primeira enzima a ser purificada e cristalizada. Essa enzima catalisa a hidrólise de ureia em dióxido de carbono e amônia.

Todos os organismos decompõem ácidos nucléicos e proteínas produzindo resíduos nitrogenados, pois os ácidos nucléicos e as proteínas contêm nitrogênio. Os mamíferos, anfíbios e alguns invertebrados libertam resíduos azotados na forma de ureia, que é produzida no fígado. A ureia é um composto especialmente indicado para a eliminação de azoto, pois é solúvel em água e menos tóxica que a amônia, no qual é o produto da excreção nos peixes, por exemplo. A urina humana contém 2% de ureia.

A uréase encontra-se em algumas bactérias e plantas e pode ser extraída com facilidade do grão de soja.

3. Objetivo

• Compreender a natureza e a ação das enzimas, entender o mecanismo das reações do biureto, reação de Heller, efeito do calor sobre as enzimas e reconhecer a especificidade.

4. Material e Reagentes

• Materiais

- Tubos de ensaio

- Pipeta graduada

- Pipetador

- Indicador vermelho de fenol

- Conta gotas

- Banho Maria

- Béquer

• Reagentes e soluções

- Urease

- Reativo de Biureto

- Ácido nítrico

- Tampão fosfato 1 mmol/L pH=7 com 1% de uréia

- Vermelho de fenol

5. Procedimentos

- Solução de Urease: Para extração da urease, foi pesado 15g de farinha de soja e colocado em um erlenmeyer. Adicionou-se 100 mL de glicerol a 75%. Fechou-se o erlenmeyer e agitou-se a suspensão por 15 minutos, sendo armazenado em refrigerador até o dia seguinte. Filtrou-se o extrato glicerinado com gaze. A solução de urease obtida dessa é estável por cerca de 6 anos quando consumida em refrigerador.

1- Reação de Biureto:

Essa reação é específica para substâncias orgânicas que possuem pelo menos dois grupos CO-NH unidos por carbono ou nitrogênio, como ocorre no biureto (NH2 – CO – NH- NH2). Obtemos o biureto pelo aquecimento de duas moléculas de uréia (NH3). O fator principal é que essa reação ocorre devido as ligações peptídicas dando positivo, a reação fica violeta, quando a presença de proteína e peptídeos com três ou mais resíduos de aminoácidos. A reação também é positiva para substâncias que contém 2 grupos carbonílicos (-CO-NH2), ligados diretamente ou através de um átomo decarbono ou nitrogênio..

Identificou-se dois tubos, sendo A e B. No tubo A colocou-se 2 gotas de urease com 2mL de água destilada. Agitou-se e adicionou-se 2mL da solução de biureto e misturou-se. No tubo B colocou-se 2mL de água destilada e 2mL de reativo de biureto, misturou-os e comparou-se a cor dos dois tubos.

2 - Reação de Heller:

Esta reação baseia-se na precipitação de proteínas por ácido forte.

Colocou-se 4 gotas da solução de urease juntamente com 2mL de água destilada em tubo de ensaio, agitou-se. Mantendo o tubo inclinado adicionou-se juntando pela parede 1mL de ácido nítrico concentrado, sem agitação, afim de formar duas fases.

3 - Teste de atividade da enzima:

A atividade da enzima pode ser demonstrada fazendo-a reagir com uma solução de uréia a pH=7, muito fracamente tamponada. A solução contem um indicador de fenol, que muda de amarelo para rosa pela subida dos valores de pH. Estando a enzima ativa ocorrerá liberação de amônia em quantidades suficientes para sobrepujar a ação do tampão tornando o meio da reação alcalina. Como consequência da subida do pH, a solução originalmente amarela, passa para a cor rosa.

Vermelho de fenol é um cristal vermelho estável ao ar, usado como um indicador de pH, que tem zona de transição a 18ºC, pH entre 6,4 - 8,0 e a 100ºC, pH entre 6,6 - 8,2, onde sua cor muda gradualmente do amarelo ao vermelho. Dependendo da concentração do indicador e da temperatura, o intervalo de mudança pode variar. Observou-se a atividade enzimática