Bioquimica Enzimas

INTRODUÇÃO

As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas. Elas estão entre as biomoléculas mais notáveis devido a sua extraordinária especificidade e poder catalítico, que são muito superiores aos dos catalisadores produzidos pelo homem. Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas.

Como catalisadores celulares extremamente poderosos, as enzimas aceleram a velocidade de uma reação, sem, no entanto participar dela como reagente ou produto. Elas atuam ainda como reguladoras deste conjunto complexo de reações e são, portanto, consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular.

  Todas as enzimas são proteínas, mas nem todas as proteínas são enzimas. As proteínas, como um todo, ocupam um papel de destaque na dinâmica e estruturação dos organismos vivos.

  As enzimas, parte deste grupo de proteínas, funcionam como catalisadores, permitindo que uma reação química venha a ocorrer dentro dos limites das temperaturas biológicas.

 Para um perfeito entendimento sobre a estrutura de uma enzima e como esta funciona, devemos considera-la tanto como uma proteína quanto um catalisador biológico.

 Como uma proteína a enzima apresenta blocos de construção denominados aminoácidos. Algumas proteínas, tais comoribonucleases, quimiotripsina e tripsina, são constituídas apenas de aminoácidos. Outras proteínas, além dos aminoácidos, contêm componentes orgânicos e inorgânicos e são denominadas de proteínas conjugadas. A peroxidase e a catalase são exemplos de enzimas com estrutura conjugada e que apresentam porfirina férrica como cofator. 

 Muitas enzimas são compostas de uma cadeia polipeptídica simples. Este é caso de enzimas como a ribonuclease, lisosima, tripsina,pepsina e algumas alfa amilases. Ao contrário, existe um grande número de enzimas que são compostas por mais de uma cadeia peptídica. A enzima lactato-desidrogenase é composta por quatro cadeias polipeptídicas. A repetição das cadeias polipeptídicas na construção de uma macromolécula de proteína caracteriza a estruturação quaternária que esta pode assumir.

No caso em questão será tratada a α-amilase, uma enzima capaz de catalisar a hidrólise do amido, transformando-o, dependendo do amido em questão, em maltose, manose, etc. esses compostos menores são ainda transformados em porções de glicose, frutose, galactose, etc. que são absorvidas pelas células e então utilizadas no metabolismo do organismo, fornecendo energia para as reações.

As α-amilases são endoenzimas, visto que atuam dentro da cadeia amilácea de forma aleatória, rompendo ligações α-1,4. Em uma suspensão de amido gelatinizada, a adição de α-amilase leva a uma queda rápida da viscosidade, evidenciando a fragmentação da cadeia polimérica.

As α-amilases são encontradas virtualmente em todas as células vivas. A ptialina (amilase salivar) e amilopsina (amilase pancreática) são α-amilases que atuam no processo digestivo. Elas podem ser obtidas com facilidade de duas fontes naturais: a saliva que contém exclusivamente amilase salivar e a urina que contém resíduos das duas amilases. Por tratar-se de uma enzima com considerado valor comercial (como no caso da degradação do amido),buscou-se nas bactérias uma fonte de α-amilases, que pudesse ser utilizada a nível industrial.

Assim como todas as enzimas, a α-amilase possui um pH (ou melhor, uma pequena faixa de pH) no qual sua eficiência é máxima, bem como uma temperatura em que atuam melhor. Independente da diluição, ou do tratamento comercial destinado à enzima, a α-amilase, de maneira geral, apresenta pH ótimo em torno de 6,0-7,0 e a temperatura em que melhor atua está entre 40 – 60°C.

Um exemplo de gráfico que representa a atividade relativa de uma enzima (que devido ao ponto de pH ótimo superior à 7, muito provavelmente não é uma α-amilase) conforme a variação pH pode ser visto a seguir:

OBJETIVO

Determinação da faixa de pH ótimo de atividade da enzima α-amilase.

MATERIAIS E MÉTODOS

Pipetas ,Pêra ,Tubos de ensaio, Solução 1% de amido solúvel em água destilada, Solução de α-amilase (solução comercial diluída 1:4200), Solução de HCl 0,1M, Solução de Iodo-KI (0,3% de iodo e 3% de KI)

Doze tubos de ensaio contendo 0,4mL de soluções tampão 0,1M de diferentes valores de pH (Tampão Citrato-Fosfato 0,1M em pH 2,6 e nos pHs 3,0; 4,0; 5,0 e 6,0; 7,0; Tampão Borato 0,1M nos pHs 8,0 e 9,0; e Tampão Borato-NaOH 0,1M nos pHs 10,0 e 11,0) e tubo controle. Água destilada, Espectrofotômetro (620nm)

   RESULTADOS E DISCUSSÃO

Com as absorbâncias obtidas no espectrofotômetro, pode-se construir a seguinte tabela:

Efeito do pH na Atividade da α-Amilase Bacteriana

Tampões Abs 620nm

Abs 620nm

Citrato-Fosfato 0,1M pH 2,6

0,532

Citrato-Fosfato 0,1M 0,1M pH 3,6

0,510

Citrato-Fosfato 0,1M 0,1M pH 4,0

0,554

Citrato-Fosfato 0,1M 0,1M pH 5,0

0,315

Citrato-Fosfato 0,1M 0,1M pH 5,6

0,279

Citrato-Fosfato 0,1M 0,1M pH 6,0

0,330

Borato 0,1M pH 8,0

0,374

Borato 0,1M pH 9,0

0,516

Borato-NaOH 0,1M pH 10,0

0,442

Borato-NaOH 0,1M pH 11,0

0,461

Tubo controle

0,535

A partir dos dados obtidos no espectrofotômetro e conhecimento das diluições que foram efetuadas, conseguiu-se realizar o cálculo das Unidades de Atividade de α- amilase (U/mL).

- Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 2,6

Subtrai-se a absorbância do tubo com pH 2,6 do tubo controle:

0,532