Inibição Da Liberação De NO Em Cultura De Macrófagos Na Presença Das Substancias X E Y Após Utilização De LPS (lipopolissacarídeo)

Inibição da liberação de NO em cultura de macrófagos na presença das substancias X e Y após utilização de LPS (lipopolissacarídeo)

Santos, A.1, Souza, B.S.1, Almeida, L.S.1, Carvalho, M.A.,2 Santos, J.L.3

1 Graduando/a em Bacharelado Biomedicina na Universidade Estadual de Santa Cruz, Departamento de Ciências Biológicas

2 Mestranda em Biotecnologia de Microorganismos na Universidade Estadual de Santa Cruz.

3 Docente da Universidade Estadual de Santa Cruz, Departamento de Ciências Biológicas

Resumo

O óxido nítrico é um mediador gasoso responsável por uma variedade de fenômenos fisiológicos. A L-arginina é a precursora da síntese do óxido nítrico, na presença de Óxido Nítrico Sintase. Este artigo estuda o efeito da atividade inibitória da substância X e Y na produção de NO em macrófagos em linhagem de células J774 estimulado por lipopoolissacarídeo (LPS). O estudo mostrou que as substancia possuem propriedades inibitórias, entretanto a produção do oxido nítrico pelos macrófagos estimulados por LPS foi inibida de forma significativa pela substancia y e não significativa pela substancia X. Através dos resultados analisados pode-se concluir que ambas substancia possuem uma propriedades antiinflamatórias ou dispõe da capacidade de neutralizar o dano oxidativo da NO e eventualmente auxilia na remodelagem da célula.

Palavras chaves

Óxido Nítrico, substância X, substância Y, lipopolissacarídeo e macrófagos.

Introdução

NO (óxido nítrico) é um gás natural formado de nitrogênio e oxigênio. A produção de óxido nítrico ocorre quando o aminoácido L-arginina é convertido para o aminoácido L-citrulina através de um grupo de enzimas conhecida como Óxido Nítrico Sintase (NOS). [2] O NO é responsável por uma série de funções no organismo e atua em diversos processos fisiológicos dentre eles a regulação do sistema imune. A ação do NO na imuno-regulação é observada na inflamação e nos mecanismos de auto-imunidade. A Óxido Nítrico Sintase (NOS) é a enzima responsável pela síntese do NO. Três isoformas de NOS são descritas, sendo uma NOS induzida (iNOS) e duas NOS constitutivas (cNOS). [1] A expressão da iNOS é o resultado de uma resposta inflamatória localizada ou difusa resultante de uma infecção ou dano tecidual. Assim, onde a resposta inflamatória é parte de uma resposta adaptativa (isto é, infecção ou sepse), a expressão de iNOS é benéfica; quando a expressão da iNOS é parte da inflamação anormal (não adaptativa), a expressão de iNOS pode ser nociva (isto é, doença autoimune).

O objetivo principal deste estudo foi avaliar a capacidade das substâncias x e y em inibir a produção de óxido nítrico (como indicativo de atividade anti-inflamatória), utilizando como estimulador da produção o LPS (lipopolissacarídeo).

Materiais e Métodos

Foi utilizada uma placa de Elisa para o ensaio enzimático com 96 poços para elaboração da curva padrão de nitrito.Designando duas colunas (16 poços) da placa para o padrão. Logo após, executou-se 7 diluições seriadas (50μl/cada) em duplicata para gerar a curva de referência Standard (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13 e 1.56μM). Ao final, o volume em cada poço é de 50μl.

Em todos os poços foi adicionado o reagente de Griess que continha solução sulfanilamida 1% e solução NEED 0,1% (naftiletilenodiamina) na concentração de 1:1. De forma que a sulfanilamida e NEED competem com o nitrito na reação de Griess, promovendo a formação de um espectro colorimétrico variando do rosa para o roxo que pode ser lido e comparado com a curva padrão em medidas de absorbância (Figura 1).

O óxido nítrico quantificado pelo acúmulo de nitrito em meio de cultura foi medido espectrofotometricamente usando reação de Griess com NaNO2 como padrão.

Em seguida, foi acrescentado o reagente de Griess em todos os poços que continham a cultura de células e a curva padrão.

A reação foi lida a 540 nm em espectrofotômetro UV/Visível de microplacas (Labsystems). O resultado foi expresso em μmols de NO por 5x 105 células através de curva-padrão obtida anteriormente com concentrações molares conhecidas de NaNO2.

Figura 1 - Placa de Elisa mostrando um espectro colorimétrico