Os Diagnósticos Moleculares

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO_________________________________________________________03

1. CONCEITOS E INFORMAÇÕES GERAIS ______________________________04 2. BASE MOLECULAR DAS DOENÇAS GENÉTICAS_______________________04 3. TESTES GENÉTICOS MOLECULARES E SUAS INDICAÇÕES____________05 3.1. Southern Blot_______________________________________________________06 3.2. RFLP (Restriction fragmente lenght polymorphism)_______________________07 3.3. Microarranjo de DNA________________________________________________07 3.4. Seqüenciamento de DNA______________________________________________08 3.5. PCR (Reação em cadeia polimerase)____________________________________08 3.6. Hibridação “in situ”__________________________________________________09 4. VANTAGENS E DESVANTAGENS DO DIAGNÓSTICO MOLECULAR_____10 CONSIDERAÇÕES FINAIS______________________________________________11

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS______________________________________12

INTRODUÇÃO

        As doenças genéticas têm se tornado um alvo de cada vez mais atenção visto que sua presença na realidade da população tem sido acentuada. Neste sentido, as metodologias de análise moleculares tem ocupado cada vez mais espaço na área de diagnóstico de doenças tanto genéticas quanto infecciosas e na prevenção do câncer, principalmente por oferecerem excelentes ferramentas laboratoriais de alta precisão. Com o aumento da esperança média de vida, torna-se muito importante o estímulo ao conhecimento das opções e funcionamento dos diagnósticos moleculares, principalmente pelos profissionais de saúde, de modo a facilitar os diagnósticos de diversas doenças. Sendo assim, este trabalho tem o objetivo de disponibilizar as principais informações acerca de diagnóstico molecular de doenças genéticas, principalmente pelos métodos mais utilizados atualmente: PCR e Hibridação.

1. CONCEITOS E INFORMAÇÕES GERAIS

        Segundo Poste (2014), diagnóstico molecular de doenças genéticas refere-se aos métodos laboratoriais que poderão ser utilizados para determinar as alterações moleculares na informação genética (seqüenciamento de DNA), bem como a interpretação desta informação (expressão genética) ao nível molecular (DNA, mRNA e proteínas). Atualmente, os avanços nos estudos desse tipo de diagnóstico resultam na disponibilidade de testes genéticos moleculares para mais de 1.500 doenças nos Estados Unidos da América (GeneTests, 2008).

        Neste sentido, a biologia molecular tem contribuído de maneira significativa para a

compreensão de como nossos genes funcionam, quando normais, bem como o porquê causam doenças quando alterados. Além disso, o diagnóstico molecular para um número crescente de patologia tem sido fundamental para evitar outros exames invasivos, identificar casais em risco e prevenir o nascimento de novos afetados, principalmente a partir do aconselhamento genético e do diagnóstico pré-natal. Atualmente, os testes diagnósticos baseados em análise de DNA são realizados em crianças e adultos com relativa facilidade, a partir de procedimentos de extração de DNA de sangue periférico, onde um volume de 5ml de sangue fornece DNA mais do que suficiente para vários testes, e se necessário, o DNA também pode ser extraído a partir de amostras muito menores de sangue, como, por exemplo, 500µl, caso o objetivo seja estudar o DNA através da PCR.

2. BASE MOLECULAR DAS DOENÇAS GENÉTICAS

        Segundo Nussbaum (2008), uma doença genética é aquela na qual o evento primário causador doença é uma mutação, seja herdada ou adquirida, ocorrendo quando há alteração molecular de um gene essencial a quantidade, a função, ou ambas, dos produtos gênicos (mRNA e proteína). Deste modo, os distúrbios genéticos podem ser classificados em monogênicos que quase sempre resultam de mutações que alteram a função da proteína, representando distúrbios causados por mutações na seqüência de DNA de um único gene; e distúrbios cromossômicos, causados por alterações estruturais e numéricas no conjunto de cromossomos.

         Historicamente, a primeira doença genética cujo mecanismo molecular foi esclarecido foi a anemia falciforme, estudada por Linus Pauling em 1949, e atualmente com o fim do Projeto Genoma Humano, espera-se uma enorme aceleração das descobertas com a introdução de novas técnicas de estudo de grande quantidades de genes e proteínas.

        O efeito da mutação no funcionamento protéico podem levar à perda da função da proteína (conseqüência mais comum da mutação), à ganho de função, à aquisição de nova propriedade e à expressão do gene em local e/ou momento errado. A perda de função de uma proteína pode ser produzida por mutações nos exons ou em regiões controladoras da expressão. Estas mutações podem ser pontuais (uma base) ou serem constituídas por deleções, inserções, inversões e outros processos, como no caso da síndrome de Turner que é causada pela perda deum cromossomo inteiro (monossomia), de modo que geralmente a gravidade da doença está relacionada com a quantidade de função retida. Muitas vezes uma pequena parcela da função original é suficiente para produzir um fenótipo discreto, quando comparado à doença causada pela perda total da função. Já nas mutações de ganho de função, a proteína é alterada, porém não significa necessariamente melhor, e há muitas doenças associadas isto, como por exemplo, acondroplastia, cujo o receptor do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR3) torna-se hiperfuncional, que fica ativado mesmo na ausência do ligante, sendo a substituição de um único aminoácido e gera como fenótipo um indivíduo de baixa estatura.

        As mutações que aumentam a produção de uma proteína normal geralmente são devidas ao aumento da dosagem gênica (uma cópia extra de cromossomo, duplicações de segmentos gênicos, descontrole do sistema de regulação da expressão, etc.), como ocorre na trissomia do par 21 (síndrome de Down), causada pelo aumento da dosagem gênica de muitas proteínas codificadas pelo cromossomo 21. Também pode ocorrer mutações de propriedade nova, onde muitas vezes a proteína ganha uma função adicional, além da que ela continua a cumprir. São muito raras, porque normalmente uma mutação reduz ou elimina uma ou mais funções da proteína, sendo o que ocorre na anemia falciforme, com mutação de um único aminoácido. Ao contrário das hemoglobinas normais, as falcêmicas agregam-se quando desoxigenadas, formando fibras que deformam as hemácias, mas sem perda da capacidade de transportar oxigênio (NUSSBAUM, 2008).