Streptococcus Grupo B De Detecção

Streptococcus Grupo B de detecção: Comparação de PCR e cultura como método de triagem para mulheres grávidas

RESUMO

Streptococcus agalactiae ou Streptococcus do grupo B ( GBS) é um dos mais importantes agentes causais de infecções neonatais graves. Vários ensaios foram avaliadas para a triagem, a fim de GBS validar um método rápido e eficiente. O objetivo deste estudo foi comparar a técnica de cultura (estabelecido como o padrão de ouro) com o método molecular de reacção em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores específicos do gene ( ATR) . Duzentos e sessenta e três amostras foram analisadas. Amostras vaginais foram coletadas, de acordo com os Centros para Controle e Prevenção de Doenças recomendações (CDC), de mulheres com mais de 35 semanas de gestação no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA).

Dois métodos de extração diferentes foram testados em todas as amostras recolhidas. Técnicas de PCR produziram 71 (26,99%) resultados positivos. A sensibilidade e especificidade para a PCR foi de 100 % e 86,88 %%, respectivamente. PCR mostraram um tempo de resposta mais curto do que o da cultura. A metodologia molecular revelou para ser útil para um rastreio de GBS, permitindo um tratamento eficaz para ser iniciado no tempo mais curto, para evitar infecção neonatal.

INTRODUÇÃO

Streptococcus agalactiae , ou grupo Lancefield Streptococcus B (GBS ) , é um dos mais importantes agente causal de infecções graves em neonatais. 40% de todas as grávidas apresentam retal e / ou vaginal colonização de GBS. A incidência de infecção GBS em neonatais é de 0,5 por 100 nascidos vivos. Vertical a transmissão da mãe para o recém-nascido quer por via de contas para até 75 % dos casos de colonização neonatal GBS, e 1% a 2% destas crianças irão desenvolver precoce GBS infecção.

Desde 2002, o Centros de Disease Control and Prevention (CDC) recomendam triagem para mulheres grávidas baseada por métodos de cultura. Este método é preferível, resultando em prevenção mais eficaz que quimioprofilaxia baseada em riscos (CDC anterior recomendação). O método padrão para o diagnóstico de GBS consiste da cultura combinado swab vaginal e anal num meio de caldo seletivo que inibe a crescimento de microrganismos não- GBS. No entanto, este método requer pelo menos 48h para a plena identificação GBS. Além disso, a cultura, resultados negativo são observados em algumas mulheres cujas crianças, posteriormente, desenvolveram a infecção GBS.

Um teste de triagem ideal para GBS é o que pode identificar com precisão, mulheres grávidas que carregam a bactéria (mesmo bactérias portadoras de contagem de baixo) e apresentando tempo de resposta curto. Muitas técnicas foram testadas a fim de validar um rápido e eficiente método de rastreio de GBS para substituir as culturas. Hoje em dia, a biologia molecular os ensaios baseados em PCR, como em cadeia da polimerase (testes de reação), tornaram-se o foco da investigação de detecção colonização de GBS em gestantes mulheres. Nesses testes, as amostras metas de preparação e ampliação são decisivas ao ensaio de desempenho. Uma boa meta para GBS é a amplificação do gene atr porque é bem estudado nesta espécie. Além disso, o ATR é um gene essencial, o que significa que tem que ser expressos / presentes em todas as células da espécie. O gene que codifica para um transportador de aminoácidos da proteína gs0538 que é extremamente específico Espécies S. Agalactiae . Porque é um serviço de limpeza do gene, a probabilidade de mutações em atr é comparativamente bastante baixa.

O objetivo do estudo foi comparar este atr gene PCR com o padrão de ouro (método de cultura de base) para avaliar a desempenho PCR como GBS triagem colonização em gestantes as mulheres. Além disso, testamos dois métodos de extrações diferentes para amplificar genes atr: um kit comercial e protocolo de lise térmica, buscando mais molecular cost-effective testes.

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostras

Espécimes retal / vaginal combinados foram coletadas para a realização deste estudo de acordo com o CDC. As amostras coletadas foram enviadas para o laboratório para a microbiologia e testes moleculares para a identificação de Streptococcus do grupo B.

Foram analisadas 263 amostras de mulheres com 35 ou mais semanas de gravidez, no parto ou não, participar da emergência sala de obstetrícia no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) desde setembro de 2007 a setembro de 2008.

Testes de microbiologia

Os esfregaços foram inoculadas em Todd Hewitt (Himedia Laboratories, Índia) meio mínimo suplementado com gentamicina ( 8 ug / ml) e ácido nalidíxico (15 mg / mL ) . O meio seletivo foi incubada a 36 ° C em 5 % de CO2 durante 18 horas, e depois subcultivadas em placas de sangue ( BioMérieux, Marcy l ` Etoile, França), que foram incubados a 36 ° C em 5 % de CO2 durante 24 h. Após incubação, as placas foram inspecionadas para colônias β - hemolíticas. Quando não são colônias β – hemolíticas foram observados após 24 horas, as placas foram reincubados por outras 24h e inspecionadas novamente. As colônias β – hemolíticas cuja morfologia foi consistente com o grupo B Streptococcus foram repicadas em caldo e submetidas ao CAMP (Christie, Atkins, Munch, Petersen) de teste. As colônias positivas para o teste de CAMP foram presumivelmente consideradas GBS.

Reação em cadeia da polimerase (PCR)

A preparação das amostras e a extração do DNA

Os esfregaços foram incubados durante 15 a 18 horas em Todd Hewitt meio seletivo. Após centrifugação do caldo, o precipitado lavou-se com uma solução de PBS e ressuspenso em 1X. Tampão TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM, pH 7,5). Este solução foi submetida a extração de ADN de dois diferentes protocolos : lise térmica e lise térmico, seguido por sílica extração do DNA pelo kit comercial.

A lise térmica foi realizada utilizando uma solução de TE para 10 min a 100 ° C para lisar a parede das células bacterianas. A segunda de extração de DNA foi realizada utilizando o comercial QIAmp kit (Qiagen , Valencia, EUA), de acordo com a instruções dos fabricantes . Este passo adicional no DNA extração foi realizada para garantir os inibidores da PCR eliminação.

Reação em cadeia da polimerase (PCR ) do gene atr

Para a reação de PCR, utilizou-se a iniciadores 5'- atr CAA CGA TTC TCT CAG CTT TGT TAA -3 ' e 5'- TAA GAA ATC TCT GCG