O DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR

 

UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR   BQI 101 – Laboratório de Bioquímica I       Relatório da Aula Prática Nº. 7   SEPARAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE AMINOACIDOS  POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL   Estudantes:  Isabela Viegas Andrade Canedo Gonçalves Da Silva – 109663 Melissa Silvana Veloso dos Santos - 107015 Geovanna Rezende de Miranda Lopes - 100412                                   Professor: Elizabeth Fontes           Número de Turma: 3             Horário da aula: Terça-Feira 10:00-12:00                 Viçosa (MG), 12 / 07/ 2022

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INTRODUÇÃO:   Cromatografia é um processo de separação e identificação de componentes de uma mistura. Essa técnica é baseada na migração dos compostos da mistura, os quais apresentam diferentes interações através de duas fases. Fase móvel: fase em que os componentes a serem isolados "correm" por um solvente fluido, que pode ser líquido ou gasoso. Fase estacionária: fase fixa em que o componente que está sendo separado ou identificado irá se fixar na superfície de outro material líquido ou sólido.

OBJETIVOS:   Compreender o processo cromatográfico, identificar os aminoácidos de diferentes substâncias, entender como se calcula o valor do Fator de Retenção, definir quem e o que são as fases moveis e estacionarias e relacionar diferentes conceitos cromatográficos (troca iônica, sorção, dessorção, partição, afinidade, exclusão molecular).

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RESULTADOS E DISCUSSÃO:  

Para iniciar a prática fizemos uma linha de partida a 2,5cm da borda do papel, e sobre essa linha fizemos quatro marcações com 5cm de distância entre cada uma, nesses pontos colocamos os nomes dos diferentes aminoácidos que iriam ser testados e pigamos uma gota de cada aminoácido em seu respectivo local, as soluções testadas foram ácido aspártico, isoleucina, prolina e uma mistura X. É importante ressaltar que nesse processo e durante todo o experimento foi necessário o uso de luvas a fim de evitar possíveis contaminações que iriam influenciar no resultado com o aparecimento de manchas. Após esse passo, o papel foi dobrado em formato cilíndrico e colocado na

cuba cromatográfica contendo um solvente e foi vedado, aguardamos 1 hora para que o solvente subisse no papel por capilaridade, após o tempo esperado o papel foi secado em uma estufa a 100 °C. Depois de seco, foi levado para capela para a aplicação do revelador, e com auxílio de um pulverizador foi aplicado a ninidrina(revelador) sobre toda área percorrida pelo solvente e novamente foi levado para a estufa para revelações das manchas. Após essas etapas foi visto uma mancha violeta no ácido aspártico, na isoleucina e na mistura x que era formado por dois aminoácidos, já na prolina e na mistura x foi visto manchas amareladas. Com a distância que o solvente percorreu no papel (12,5cm) dividido pela distância percorrido pelas substâncias (medida com uma régua a parti da linha de partida até o meio da mancha formada por cada substância) foi possível calcular o fator de retenção: Ac. Asp: 0,5/12,5= 0,04 Isoleucina: 4/12,5= 0,32 Prolina: 1,5/12,5= 0,12 X(violeta): 4/12,5= 0,32 X(amarela): 1,5/12,5= 0,12 Dessa forma foi possível identificar que a mistura X era formada por Isoleucina e prolina, porque o fator de retenção deu os mesmos resultados. Também foi identificado a fase estacionaria (água), suporte (celulose do papel) e fase móvel (solvente)     EXERCICIOS:  1) Defina cromatografia e dê um exemplo de separação. O termo cromatografia deriva do grego “chrom” (cor) e “graphe” (escrever). A cromatografia é uma técnica quantitativa, tem por finalidade geral duas utilizações, a de identificação de substâncias e de separação-purificação de misturas. Usando propriedades como solubilidade, tamanho e massa. Para o processo de separação de misturas, a mistura passa por duas fases sendo uma estacionaria (fixa, sendo um material poroso como um filtro) e outra móvel (como um liquido ou um gás, que ajuda na separação da mistura), sendo que os constituintes

dessas misturas interagem com as fases através de forças intermoleculares e iônicas, fazendo a separação. A mistura pode ser separada em várias partes distinta ou ainda ser purificada eliminando-se as substancia indesejáveis. Classificação pelo modo de separação temos a cromatografia de partição se dá pela diferença de solubilidade das substancias que devem ser liquidas, e sua separação se dá com o auxílio de filtros de papel ou em colunas como suporte. 2) Faça o esquema de um cromatograma dos aminoácidos aspartato e leucina usando o sistema de solvente empregado na aula prática. Para isso, pesquise as estruturas e os valores de pK (consulte a Tabela 6.2 e o item 6.9). Justifique seus valores de Rf. Ac. Asp: Rf = 0,5/12,5 = 0,04 Isoleucina:   Rf = 4/12,5= 0,32 3) Qual é a função da ninidrina? Que grupo do aminoácido reage com a ninidrina? Quantas moléculas de ninidrina reagem com um alfa- aminoácido? É comumente usada para detectar impressões digitais. Reage com a amina primária e secundárias. A reação da ninidrina com aminoácidos ocorre em algumas etapas. Primeiramente, a ninidrina sofre uma desidratação, seguida de uma descarboxilação.

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