Bio Química Quitosanal Mimosa

1. Resumo

Na busca de uma planta que exibe actividade osteogénica, Mimosa tenuiflora (M. tenuiflora) córtex representa a oportunidade para criar um biomaterial que, em conjunto com o quitosano, é osteocondutora e promover uma melhor e rápida regeneração do tecido ósseo. Assim, o compósito de quitosano / M. tenuiflora córtex fabricado terão propriedades de biocompatibilidade e permitir a proliferação de osteoblastos. Compósitos foram desenvolvidos com diferentes concentrações de quitosano / M. tenuiflora córtex (w / w) utilizando a técnica de separação de fases termicamente induzida (TIPS). Para analisar os efeitos do composto em osteoblastos, culturas primárias, cada amostra foi coletada nos dias 1, 3 e 7 após a semeadura. A avaliação consistiu de compósitos de testes de viabilidade e proliferação nos quais observamos a actividade metabólica das células, utilizando o reagente MTT e determinada a concentração de DNA por meio de fluorescência. A expressão do marcador de fosfatase alcalina (ALP) utilizando fosfato de p-nitrofenilo foi examinada, permitindo a observação da actividade de proliferação e diferenciação de células osteoblásticas. Além disso, uma análise de biomineralização foi realizada por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), espectroscopia por dispersão de energia, espectroscopia de infravermelho e de difração de raios-X. Os resultados mostraram que 80/20 quitosano / M. tenuiflora córtex biocomposite tem o melhor desempenho com osteoblastos em comparação com biomateriais 100/0 e 70/30 quitosana / M. compósitos tenuiflora. Finalmente, determinou-se que o compósito de quitosano / M. tenuiflora córtex apresenta nenhuma citotoxicidade e aumenta a capacidade de os osteoblastos a proliferar e diferenciar-se.

1. Introdução

O tecido ósseo é uma estrutura importante para o apoio e movimento do corpo. Os ossos têm a capacidade de ser constantemente renovado através de um processo chamado de remodelação, o que por vezes não é muito eficaz. Nos últimos anos, o uso de quitosano na regeneração óssea tem provado ser um tratamento eficaz porque é osteocompatible, biodegradável, e osteocondutora [1]. A ideia de encontrar uma substância natural que permite a melhoria das propriedades da quitosana no tecido ósseo tenha sido focada para as plantas que são osteogénico. Algumas plantas têm demonstrado a capacidade de regenerar osso, como, Elephantopus mollis e Spilanthes Africano, as plantas que estão localizados nos Camarões (África).

Os resultados mostraram que extratos das folhas e galhos de E. mollis e S. Africano planta inteira aumento da deposição mineral no tecido, fazendo com que o crescimento do osso onde a fratura ou lesão é localizada. Este aumento é atribuído à diferenciação de células progenitoras da medula óssea, células da linhagem ontogênicos, e aumento do recrutamento de osteoblastos no local da fractura [2]. Existe também o caso de Cissus Quadrangularis, uma planta medicinal que tem uma actividade da osteogénese, e que está a ganhar grande interesse como um agente terapêutico para melhorar a cicatrização de ossos [3].

No México, M. tenuiflora é uma planta com actividade osteogénica, que podem ser facilmente adquiridas, é acessível e é economicamente viável. M. tenuiflora córtex foi utilizado durante décadas como um remédio para o tratamento de feridas e queimaduras da pele [4], devido à sua capacidade de curar, anti-inflamação e actividade antimicrobiana. A acção dos componentes do córtex no tecido epitelial demonstraram o seu potencial para estimular a proliferação de fibroblastos e de células epiteliais.

Devido aos compostos orgânicos que contém, é possível que esta é a razão para a sua reacção ao tecido da pele. Triterpenos saponinas identificados como Mimonosidas A, B, e C; tannis; esteróides como campesterol-3-Ob-D-glucopiranosilo,

estigmasterol-3-O-b-D-glucopiranosilo, e b-sitosterol-3-O-b-D-glucopiranosilo, são alguns dos componentes do córtex que se crê ser responsável por esta actividade de [5]. Porque fibroblastos e osteoblastos são linhas celulares semelhantes, M. tenuiflora poderia activar a proliferação de osteoblastos, como acontece com os fibroblastos. Incorporando M.tenuiflora córtex de quitosano obteria um compósito contendo as propriedades benéficas dos dois componentes, conduzindo a uma melhor regeneração óssea. Embora os efeitos de M. tenuiflora córtex na bioactividade do quitosano compósito córtex / M.Tenuiflora foi avaliado anteriormente no nosso laboratório [6] e demonstraram a capacidade dos compostos para formar na sua superfície uma camada mineralizada, a interacção de células com o material deve ser testado. Assim, no presente estudo que investigou o comportamento de osteoblastos primários cultivados na presença de quitosano e Mimosa tenuiflora. Em seguida, foram avaliados biomineralização, a actividade de fosfatase alcalina (ALP), a viabilidade das células e o ADN total de osteoblastos nos andaimes.

3. Experimental

Para a preparação de 80/20, 70/30 e 100/0 (w / w) de compósitos de quitosana/M.tenuiflora foram utilizados em uma metodologia previamente relatada [7]. A quitosana (Carbomer, Estados Unidos) e M. córtex tenuiflora (Jiquipilas Chiapas, México) foram lentamente adicionado à solução aquosa de 1% (% v / v) de ácido acético (Mallinckrodt, Estados Unidos). A solução foi colocada num congelador a  durante três horas e liofilizada durante 72 h. Finalmente, os compósitos foram neutralizados. [pic 1]

Todos os compósitos foram semeadas com células de osteoblastos calvária primários obtido a partir de ratos Wistar por digestão com colagenase. 50.000 células por amostra foram cultivadas, em diferentes períodos de tempo, em  suplementado com soro fetal de bovino (FBS), penicilina-estreptomicina, , e ácido ascórbico. A viabilidade celular foi determinada utilizando-se 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). Em cada ponto de tempo, a solução de MTT  e   contendo FBS e antibióticos foram adicionados a cada composto. Após 3 h de incubação,  de sulfóxido de dimetilo (DMSO) foi adicionada para dissolver o produto de formazano, e a absorvância a  foi medida utilizando um sinal de adição, micro-placa espectrofotómetro. O número de células foi determinado utilizando uma curva padrão. A análise da proliferação celular através da contagem total de DNA foi avaliada num kit quantit ™ PicoGreen dsDNA. Os suportes foram lavados com PBS e  de MilliQ-desionizada com adição de água, seguido por três ciclos de congelação-descongelação. As amostras foram centrifugadas para remover os fragmentos dos andaimes e o sobrenadante foi utilizado em uma quantificação de DNA total. Resumidamente,  de amostra,  de tampão TE, e  de solução de trabalho PicoGreen foram adicionados numa célula de quartzo. Depois de 8 min de incubação no escuro, a célula de quartzo foi lida num espectrofluorimetro a 480nm e a intensidade de emissão de fluorescência a 520nm foi medida. O quantidade de DNA foi determinada com base na curva padrão. A atividade de ALP foi medida com a mesma amostra, como usado para o ensaio de DNA. Subsequentemente,  de cada amostra  foi adicionado a  de p-nitrofenilfosfato em uma placa de 96 poços e incubou-se durante 30 min. A reação foi parada pela adição de  de 2M NaOH (solução) de e a placa a 405nm.[pic 2][pic 3][pic 4][pic 5][pic 6][pic 7][pic 8][pic 9][pic 10][pic 11][pic 12][pic 13][pic 14][pic 15]