MÉTODO DE ESTERILIZAÇÃO COM FOCO EM: PROTOCOLO DE MICROPROPAGAÇÃO PARA AS ESPÉCIES

UNIVERSIDADE TÉCNOLOGICA FEDERAL DO PARANÁ - CAMPUS TOLEDO

CURSO DE ENGENHARIA DE BIOPROCESSOS E BIOTECNOLOGIA

Brahms Raymundo; Leonardo Marques

MÉTODO DE ESTERILIZAÇÃO COM FOCO EM:

PROTOCOLO DE MICROPROPAGAÇÃO PARA AS ESPÉCIES Piper hispidinervum e P. aduncum

TOLEDO

2021

Brahms Raymundo; Leonardo Marques

MÉTODO DE ESTERILIZAÇÃO COM FOCO EM:

PROTOCOLO DE MICROPROPAGAÇÃO PARA AS ESPÉCIES Piper hispidinervum e P. aduncum

Trabalho de revisão bibliográfica apresentado na disciplina de esterilização de equipamentos, meios e ar em Bioprocessos, do curso de Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia.

Prof. Luís Felipe Minozzo Figueiredo

Toledo

2021

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MICROPROPAGAÇÃO

A micropropagação é uma técnica biotecnológica que visa a obtenção de mudas ou clones de plantas a partir do cultivo in vitro das mesmas, utilizando estruturas das plantas, como o meristema, sementes, raízes ou calos. Tanto as sementes como o meristema possuem estruturas que dificultam a presença de patógenos e contaminações, que podem ser empecilho no cultivo.[1,2]

Como qualquer cultivo in vitro a esterilidade é essencial, para não haver competição por nutrientes ou desenvolvimento de doenças nas plantas geradas, por isso é essencial etapas de desinfecção nos explantes coletados, porém por se tratarem de plantas não pode-se adotar exclusivamente métodos convencionais de esterilização em um laboratório de cultura de tecidos.[2,3]

Os meios de cultura contendo compostos inorgânicos podem ser esterilizados em autoclave a 121ºC a uma pressão de 1,05kg/cm3, entretanto o mesmo não se aplica a alguns compostos orgânicos, principalmente controladores de crescimento, como as auxinas e citocinas, por isso as soluções dos mesmos devem ser esterilizados por filtração com poros de tamanhos de 0,22µm de diâmetro, em pequenos volumes por vez, por volta de 10 a 20mL, e adicionados ao meio de cultura autoclavado uma temperatura próxima a 45°C, este processo deve ser realizado em um fluxo laminar, utilizando micropipetas também esterilizados por autoclave.[1]

O fluxo laminar também deve apresentar condições de assepsia elevadas, utilizando álcool 70% a 90% para sua limpeza, e sendo necessário a correta operação do mesmo, ligando o fluxo e as lâmpadas ultravioleta, 10 e 20 minutos antes de iniciar a operação, respectivamente. Após a utilização o fluxo deve ser mantido ligado por mais 5 minutos e novamente limpo utilizando álcool.[1,3]

Porém mesmo garantindo que tanto o ambiente quanto o meio sejam estéreis precisa-se garantir que os mesmo se aplique aos explantes, primeiramente a amostra deve ser coletada de uma planta sadia, sem sinais de doenças ou infecções.[2,3]

Porém mesmo assim é necessário fazer a higienização do mesmo, para isso faz-se a limpeza superficial do explante, utilizando métodos químicos, como sabão, álcool e hipoclorito de sódio. Os tempos de lavagem e métodos utilizados podem variar a depender da espécie, e do tipo de explante, lembrando que é necessário desinfetar a planta, mas sem matá-la no processo.[1-3]

OBJETOS DE ESTUDO

O processo biotecnológico em que estudou-se as práticas de esterilização e desinfecção foi o micropropagação para as espécies de Piper hispidinervum e P. aduncum, apresentado no protocolo da EMBRAPA[4]. A espécie P. hispidinervum, conhecida como pimenta – longa, possui alto teor de safrol em seu óleo essencial, que tem utilização em cosméticos, perfumes e inseticidas. Já a P. aduncum, popularmente conhecida como pimenta-de-macaco, tem em seu óleo essencial o dilapiol que tem efeito inseticida, além de atividade fungicida, moluscida, bactericida e antibiótico.

Como há uma crescente demanda da implantação do cultivo das espécies Piper, no momento atual há a limitante da oferta de mudas, portanto, sua produção em laboratório por meio da técnica de micropropagação é uma alternativa viável.

TÉCNICAS DE DESINFECÇÃO E ESTERILIZAÇÃO EMPREGADAS NO PROCEDIMENTO

No processo utilizou-se cultivo de mudas a partir de sementes, os meios de cultivos, foram dispostos em frascos de 250 mL e autoclavados por 15 minutos a 1,1kgf/cm3, em temperatura de 121°C.

As sementes foram colocadas em um becker de 50 mL e lavadas em agua corrente contendo cinco gotas de detergente por 5 minutos, seguido por três lavagens em água destilada e esterilizada, posteriormente as mesmas foram levadas para o fluxo laminar onde foram mergulhas em álcool etílico 70% por 1 minuto, e a seguir deixadas de molho em solução de hipoclorito de sódio, com cloro ativo de 2,5%, por 30 minutos.