Relatírio de ph otimo enzimatico

Introdução

Uma das muito importantes capacidades de um ser vivo é a de catalisar reações essenciais para o funcionamento do organismo. Reações como para obtenção de energia são, normalmente, extremamente lentas para as necessidades do indivíduo.Para que elas sejam viáveis, a ação de catalizadores é indispensável. As enzimas atuam como catalizadores de grande eficiência, tendo, assim, grande papel na manutenção da vida dos seres vivos. Sua especificidade de substratos, aumento na velocidade de reação e condições para atividade mais brandas de temperatura e pH em soluções aquosas as diferenciam de grande parte de catalizadores sintéticos e inorgânicos(NELSON, COX, LEHNINGER.2009).

As enzimas são proteínas altamente diferenciadas, cujo estudo tem alta relevância em desenvolvimento de medicamentos e de doenças de herança genética, que podem ter como causa excesso ou carência na produção dessas proteínas. Muitas enzimas foram classificadas em relação ao substrato que catalisam. Como exemplo, tem-se a urease, que catalisa a hidrólise da uréia.(NELSON, COX, LEHNINGER.2009).

A atividade das enzimas dependem, dentre outros fatores, do pH do meio de reação. Assim, em alguns pH sua atividade aumenta e em outros, diminui. O pH, ou faixa de pH, em que sua atividade é máxima é chamado de pH ótimo. Isso pode ser explicado pelo fato que o estado de ionização das cadeia laterias dos aminoácidos do centro ativo atuam na manutenção da estrutura da proteína. Assim, o pH pode influenciar na conformação ativa da enzima, influenciando em sua atividade.(NELSON, COX, LEHNINGER.2009).

Objetivos

O objetivo da aula prática foi determinar a faixa de pH ótimo na ação de catálise da enzima utilizada, no caso, da  〈-amilase bacteriana.

Materiais e Métodos

Para o grupo foi designada α-amilase ( enzima bacteriana comercial Termamyl 120L) diluída em 1:1000.

Foram fornecidos 10 tubos de ensaio contendo 0,4 ml de solução tampão citrato-fosfato 0,1 mol/L de diferentes pH( 2,6 , 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 e 7,0) e de tampão borato 0,1 mol/L de pH 8 e 9 e de tampão borato-NaOH 0,1 mol/L de pH 10 e 11.

Em cada tubo pipetou-se próximo ao fundo dos tubos 0,5 mL de solução 1% de amido solúvel, fornecida pelos técnicos do laboratório. Após cada adição, o tubos era agitado. Incubaram-se os tubos de ensaio durante 10 minutos em um banho de água termoestatizado, a fim de equilibrar a temperatura, a temperatura de 50 0C, Após decorrido esse tempo, adicionou-se 0,1 mL de solução de α-amilase nos tubos e, após a adição, cada tubo foi agitado, ainda incubados. Foi adicionado 0,5 mL de HCl 0,1 mol/L, fornecida, após decorridos 5 minutos de reação, agitando o tubo. Para que o tempo de reação em cada tubo não ultrapassasse 5 minutos, a adição de α-amilase foi feita em cada tubo a cada 20 segundos.

Então, os tubos foram retirados do banho e levado à bancada, 0,1 mL de solução iodo-KI( 0,3 % de iodo e 3% de KI), fornecida, foi adicionada em cada tubo e o volume resultante das adições foi completado de água destilada, com auxílio de uma pipeta graduada, até atingir 15 mL. Os tubos foram tampados com papel filme e misturados por inversão.

Concomitantemente, outra integrante do gruo preparou os tubo Branco e Controle, a serem utilizados na leitura de absorbância. No tubo Branco, foram adicionados 0,1 mL de solução de iodo e 14,9 mL de água destilada. Esse tubo foi tampado com papel filme e misturado por inversão. No tubo Controle, foram adicionados 0,5 mL de solucão 1% de amido solúvel; 0,5 mL de água destilada; 0,1 mL de solução iodo-KI, acima mencionada, e 0,5 ml de HCl 0,1 mol/L. O tubo foi agitado para homogeinização e o volume resultante das adições foi completado até 15 mL com água destilada. O tubo foi tampado com papel filme e misturado por inversão.

Na leitura de absorbância, o espectrofotômetro a 620 nm foi calibrado com o tubo Branco e as absorbâncias do controle e das amostras foram medidas, da solução mais clara para a mais escura. Os resultados foram anotados para cálculo da atividade da α-amilase.

Resultados e Discussão

O quadro abaixo apresenta os resultados obtidos experimentalmente.

Quadro 1: Efeito do pH na Atividade da 〈-amilase bacteriana

Tampões	Abs 620 nm	Unidades de Atividade de 〈-amilase (U/mL de enzima comercial)	% Atividade Relativa
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 2,6	1,208	484.000	17,3
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 3,0	1,305	290.000	10,4
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 4,0	0,103	2.694.000	96,4
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 5,0	0,089	2.722.000	97,4
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0	0,053	2.794.000	100
Citrato-Fosfato 0,1 Mol/L pH 7,0	0,095	2.710.000	97,0
Borato 0,1 Mol/L pH 8,0	0,202	2.496.000	89,3
Borato 0,1 Mol/L pH 9,0	0,060	2.780.000	99,5
Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 10,0	0,184	2.532.000	90,6
Borato-NaOH 0,1 Mol/L pH 11,0	0,103	2.694.000	96,4
Tubo controle	1,450	0	-