SENSORES ELETROQUÍMICOS: CONSIDERAÇÕES SOBRE MECANISMOS DE FUNCIONAMENTO E APLICAÇÕES NO MONITORAMENTO DE ESPECIES QUÍMICAS EM AMBIENTES MICROSCOPICO

SENSORES ELETROQUÍMICOS: CONSIDERAÇÕES SOBRE MECANISMOS DE FUNCIONAMENTO E

APLICAÇÕES NO MONITORAMENTO DE ESPÉCIES QUÍMICAS EM AMBIENTES MICROSCÓPICOS

INTRODUÇÃO

O atual panorama da Eletroanalítica

As técnicas eletroquímicas constituem-se em poderosa ferramenta

para os químicos analíticos na resolução de seus problemas, especialmente

por causa de algumas características vantajosas como a

elevada sensibilidade das determinações, custo moderado e

portabilidade1-3. A versatilidade das técnicas eletroquímicas também

merece destaque visto que é possível controlar as reações eletródicas

modificando a interface eletrodo-solução e selecionando-se

criteriosamente o potencial aplicado à célula. A facilidade de

automação em virtude da medição de sinais elétricos, a possibilidade

de proceder à especiação de íons metálicos em certos casos e a “compatibilidade

ambiental”, pois o reagente empregado é o elétron, também

consistem em aspectos que conferem aos métodos eletroanalíticos

uma posição de destaque no contexto da Química Analítica.

Inerentes às propriedades acima destacadas, aparecem aspectos

desvantajosos das medições eletroquímicas, principalmente quando

comparadas às efetuadas com técnicas espectroscópicas. Um dos

problemas refere-se à interação do eletrodo com a amostra, que em

muitos casos ocasiona perda ou irreprodutibilidade nas medidas. O

conjunto de compostos passíveis de determinação eletroanalítica

também é menos abrangente que no caso das técnicas espectroscópicas.

Finalmente, deve-se destacar a natural aversão às técnicas

eletroquímicas em razão do sofisticado e nem sempre muito bem

compreendido processo heterogêneo de transferência de elétrons

que ocorre na interface eletrodo-solução.

No atual panorama da Eletroanalítica, pesquisas nas quais se

utilizam detectores amperométricos acoplados a sistemas de separação

têm recebido atenção crescente, especialmente nos casos em

que se deseja a miniaturização do sistema analítico4-16. Uma justificativa

para esta motivação inclui a disponibilidade de tecnologias

que facilmente viabilizam a fabricação de eletrodos em escala

micrométrica, a preços relativamente baixos. Além disso, a sensibilidade

das determinações não é comprometida pela redução do tamanho

do sensor ou da célula, como é o caso dos métodos

espectroscópicos, uma vez que a reação de interesse ocorre na região

interfacial eletrodo/solução e, portanto, não depende do volume

da amostra. Alta sensibilidade analítica pode também ser obtida

empregando-se espectroscopia de massa ou fluorescência por laser

induzido17. Entretanto, os instrumentos requeridos para o emprego

destas técnicas são muito mais caros e de maior porte que um

potenciostato, o qual pode ser facilmente construído em um “chip”

de poucos centímetros. Desta forma, a fabricação de sistemas analíticos

compactos que empregam detecção amperométrica tem sido

proposta na literatura e o aspecto diferencial prende-se à possibilidade

de realizar todas as operações analíticas de maneira integrada

e contínua em um único instrumento8,15,16. Há vários exemplos na

literatura em que a associação da eletroforese capilar com detecção

amperométrica é proposta no desenvolvimento de equipamentos internacionalmente

conhecidos como μTAS (“micro total analysis

system”) ou “lab-on-a-chip”18-20. Ainda no que tange ao uso de

detectores amperométricos em sistemas hidrodinâmicos, cumpre

destacar que a possibilidade de redução da exposição do eletrodo a

contaminações provenientes de amostras reais constitui-se em fator

relevante e que justifica os seguidos progressos oriundos da

introdução de amostras por sistemas FIA ou BIA (“batch injection

analysis”)21,22.

Sensores eletroquímicos: um panorama resumido

Sensores químicos são dispositivos que permitem a coleta de

dados e obtenção de informações com manipulação mínima do sistema

estudado. Desta forma, os resultados obtidos podem ser analisados

e correlacionados com outros parâmetros no ambiente em que

estão inseridos. Estes dispositivos possuem características peculiares

que os distinguem de métodos instrumentais de largo porte, os

quais, por usa vez, são cada vez mais precisos, sensíveis e seletivos,

mas não permitem a obtenção de informações in situ e em

Vol. 29, No. 6 Sensores eletroquímicos 1319

tempo real. Dados nestas condições experimentais são facilmente

obtidos com sensores e, mesmo que as medidas não tenham precisão

e exatidão comparáveis às dos métodos instrumentais, em muitas

ocasiões têm-se elementos suficientes para tomadas de decisão.

Características vantajosas também inerentes ao uso de sensores

químicos referem-se à portabilidade, facilidade de automação, possibilidade

de miniaturização e baixo custo.

A Figura 1 apresenta um esquema geral dos principais componentes

de um sensor químico. A obtenção de informação analítica

depende essencialmente da capacidade da membrana, usualmente

posicionada na extremidade do dispositivo, em reconhecer a espécie

de interesse de maneira seletiva. Há inúmeras alternativas de

imobilização desta membrana na superfície do sensor e um aspecto

relevante associado a esta operação envolve a necessidade de acesso

a algum processo químico que viabilize a transdução do sinal

para o detector. Por sua vez, o sinal transmitido deve ser maximizado

em relação às informações sobre o analito, ou seja, deseja-se

minimizar o efeito de contribuições estranhas como, por ex., interferentes,

ruídos eletrônicos ou erros experimentais. Neste sentido,

a efetiva capacidade do dispositivo em discriminar o analito constitui-

se em aspecto de grande importância na fabricação de sensores

de uso geral e em larga escala, devendo-se ressaltar, entretanto, que

aspectos referentes à sensibilidade, estabilidade e robustez também

devem ser considerados.

Dentre os sensores químicos, há várias classificações possíveis

as quais podem se basear no tamanho, tipo de aplicação ou mecanismo

de transdução da resposta. De acordo com o banco de dados

do ISI Web of KnowledgeSM, 46702 artigos científicos foram publicados

contendo a palavra-chave “sensor” ou “sensors”, desde 2000.

Estes trabalhos referem-se a investigações com sensores de diversos

tipos e incluem transdução potenciométrica, amperométrica,

piezoelétrica, óptica, térmica, condutométrica, entre outras. Percebe-

se, portanto, a vastidão de uma área vigorosamente crescente e

não é intenção deste artigo fazer uma revisão de amplitude tão larga.

Mesmo no que concerne às técnicas eletroquímicas, verifica-se

a existência de milhares de trabalhos sobre o assunto em que são

abordados tópicos sobre novos materiais, aplicações em amostras

ambientais, biológicas e de interesse industrial, novos métodos de

fabricação, estratégias para melhoria na seletividade e nos limites

de detecção, etc. O vigor nesta área é atestado pela publicação de

2678 artigos em igual período de tempo, selecionados com base nas

palavras-chave “electrochemical and sensor” e “electrochemical and

sensors”, alguns dos quais consistindo em excelentes e abrangentes

revisões relativamente recentes sobre o tema23-34. Aplicações destes

dispositivos para obtenção de informações no campo e em amostras

de interesse ambiental23,24,30,33 exemplificam a importância desta área

de pesquisa no contexto social, econômico e da saúde.

A fabricação de sensores descartáveis35-37 e o desenvolvimento

de tecnologias que permitem a imobilização de enzimas em sistemas

eletródicos para confecção de biossensores com elevada estabilidade

também têm atraído o contínuo interesse de pesquisadores

ligados à Eletroanalítica38-42. Sofisticados métodos para “screenprinting”

surgem rotineiramente na literatura43-46 e a possibilidade

de fabricação de microeletrodos isolados ou na forma de “arrays”,

os quais viabilizam ganho de sensibilidade e abrem perspectivas

para monitoramento multielementar47,48, impulsionam pesquisas

com vistas a aplicações rotineiras dos dispositivos.

O foco do presente artigo

Como pôde ser evidenciado nos tópicos anteriores, existe uma

ampla gama de motivações e inovações tecnológicas que ampliaram

de maneira exponencial as fronteiras de atuação da

Eletroanalítica e, em particular, o campo associado ao desenvolvimento

de sensores eletroquímicos. Como já frisado, há revisões

extensas e recentes sobre o tema, incluindo compilações na área de

eletrodos modificados e biossensores. De outro lado, a aplicação de

sensores amperométricos no estudo de sistemas biológicos constitui-

se em área menos explorada, mas que tem recebido incentivo

devido às atraentes perspectivas. Em um contexto crescentemente

interdisciplinar, em que a busca de informações em sistemas biológicos

tem sido cada vez mais importante para compreensão do mecanismo

de funcionamento das células, destaca-se a área de fabricação

de sensores miniaturizados. Os resultados de experimentos

eletroquímicos conduzidos com eletrodos que possuem pelo

menos uma das dimensões em escala micrométrica são bastante

distintos em função do diferenciado mecanismo de transporte de

massa (vide seção adiante), viabilizando medições de corrente em

estado estacionário (ou seja, o sinal medido independe do tempo)49-

52. Outra particularidade destes eletrodos prende-se à possibilidade

de construção de dispositivos estruturalmente microscópicos e desta

forma, se descortina um vasto campo de atuação da eletroquímica

em que se estudam moléculas confinadas em volumes muito pequenos

de solução. A presente revisão almeja contextualizar este assunto

apresentando alguns dos princípios fundamentais que norteiam

os progressos neste campo de pesquisa, assim como exemplos

ilustrativos de aplicações práticas destes sensores miniaturizados.

No ambiente celular, os dispositivos usualmente operam no modo

amperométrico e, portanto, apresentam reduzida seletividade. Justificam-

se, desta maneira, estratégias para a modificação da superfície

eletródica, quer seja para fins de eletrocatálise, como para restrição

da passagem de espécies interferentes. Comparativamente aos inúmeros

trabalhos descritivos sobre métodos de modificação de superfícies

eletródicas, menos ênfase tem sido dada na literatura ao uso de

ferramentas para a compreensão dos diversos fatores que influenciam

a resposta nos eletrodos modificados. Assim, pretende-se abordar

o assunto relativo a eletrodos modificados levando em consideração

aspectos vinculados a propriedades da estrutura, composição e dinâmica

das reações eletródicas e, sempre que possível, exemplos de

nossas contribuições nesta área serão apresentados.

ASPECTOS FUNDAMENTAIS SOBRE SENSORES

ELETROQUÍMICOS

Importância da modificação da superfície do eletrodo

Os sensores amperométricos constituem-se em dispositivos mantidos

em potencial fixo e que propiciam sinais de corrente faradaica

proporcionais à concentração do analito, em função de processos

eletródicos que ocorrem na interface eletrodo/solução. Todavia, a corrente

medida em experimentos eletroquímicos também possui um componente

capacitivo, associado a mudanças da capacitância da dupla

camada elétrica durante variações de potencial. A Figura 2 representa,

de maneira esquemática, a influência da concentração da espécie

eletroativa para ambas as situações e observa-se claramente que a busca

de informações sobre a concentração da espécie eletroativa depende

de uma nítida distinção entre as correntes capacitiva e faradaica. Pela

análise da figura conclui-se que informações analíticas em concentra-

Figura 1. Esquema geral dos principais componentes de um sensor químico

1320 Lowinsohn e Bertotti Quim. Nova

ções mais baixas podem ser obtidas com mais confiabilidade melhorando-

se a sensibilidade das determinações (aumento da inclinação da

reta, curva IF(B)) e/ou pela diminuição da corrente capacitiva, condições

nas quais a discriminação entre correntes faradaica e capacitiva é

otimizada. Visto que no caso de sensores amperométricos o potencial é

mantido constante durante a medição da corrente, deve-se destacar

também a importância da avaliação da seletividade das determinações

uma vez que, via de regra, em amostras complexas podem existir espécies

químicas que também são eletroativas no potencial selecionado.

Uma estratégia elegante para superar os problemas de seletividade

acima considerados envolve a modificação da superfície eletródica.

Algumas décadas atrás três atributos principais eram requeridos em

um eletrodo de trabalho utilizado em experimentos eletroquímicos: boa

condutividade, estabilidade química perante processos redox em solução

e larga faixa de potencial de trabalho. Desde então, essas premissas

passaram a ter um significado menos importante uma vez que, para

determinados sistemas químicos, percebeu-se a necessidade do trabalho

com superfícies seletivamente reativas, as quais proporcionavam

resultados favoráveis em razão da melhoria da atividade química53.

O uso de reagentes moleculares para manipular deliberadamente

a superfície de eletrodos tem vasta aplicação em Eletroanalítica, pois

conduz a melhoria na capacidade de reconhecimento e/ou na amplificação

de sinais de corrente, ao mesmo tempo em que pode tornar as

determinações mais seletivas pelo efeito eletrocatalítico (diminuição

da sobretensão dos processos eletródicos) ou pela restrição da passagem

de espécies interferentes empregando-se membranas apropriadas.

Os procedimentos acima descritos têm estreita associação com o

termo “eletrodos quimicamente modificados”54 e visto que o objetivo

do uso de sensores amperométricos está centrado na medição de sinais

de corrente em matrizes de natureza complexa (fluidos biológicos,

águas naturais, alimentos, etc), a modificação da superfície

eletródica é, na maioria dos casos, necessária para que se atinjam os

propósitos desejados. Entretanto, cabe destacar que em algumas situações

favoráveis as medições podem ser feitas com eletrodos sem

qualquer tipo de modificação, como no caso do monitoramento da

concentração de ácido ascórbico em frutas cítricas empregando-se

microeletrodos de ouro55 e platina56. Isto é viável pois estudos realizados

com suco de laranja por nosso grupo de trabalho empregando a

enzima ascorbato oxidase demonstraram a ausência de outras espécies

eletroativas no potencial de trabalho. Outro exemplo também interessante

é a determinação direta de vitamina E em óleos e gorduras

vegetais utilizando microeletrodos de platina57.

A importância da funcionalização da superfície eletródica propiciou

a criação de uma área com fronteiras bastante abrangentes e nas

últimas décadas os trabalhos têm se estendido desde estudos fundamentais

até aplicações práticas. A engenhosidade dos químicos tem

levado à proposição de inúmeras estratégias para a imobilização deliberada

de espécies químicas na superfície de eletrodos sólidos e há

revisões bastante completas sobre este assunto54, 58-62, razão pela qual

não se pretende abordar este tema no presente artigo.

Técnicas para caracterização da atuação do filme modificador

O trabalho com monocamadas é desejável, pois pode-se ter um

controle mais preciso do grau de funcionalização da superfície63.

Todavia, na maior parte dos casos trabalha-se com multicamadas,

que viabilizam um efeito catalítico em escala tridimensional devido

à difusão do substrato pelo filme64. Investigações com filmes

mais espessos dão ensejo a uma influência significativa da estrutura

da camada imobilizada na dinâmica do processo global de eletrodo

e inter-relações entre estes dois parâmetros são bastante relevantes

ao se lidar com eletrodos modificados.

Na avaliação da eficiência catalítica de um eletrodo modificado,

fatores relacionados à difusão do substrato na solução, propagação da

carga elétrica no filme, penetração do substrato no filme e posterior

difusão e velocidade da etapa de transferência eletrônica entre mediador

e substrato devem ser considerados65-69. A Figura 3 ilustra as

diferentes etapas deste processo dinâmico, investigado por Saveant e

colaboradores66. Estes autores estudaram de maneira qualitativa e

quantitativa os perfis de concentração esperados para situações em

que os parâmetros acima descritos são considerados. O objetivo destes

estudos consiste na avaliação da relevância da contribuição de

cada um dos parâmetros na cinética do processo global de eletrodo.

As diferentes combinações produzem subcasos definidos pela localização

da zona de reação no filme, os quais podem ser caracterizados

aumentando-se o regime de transporte de material à superfície

eletródica. Para tanto, o uso de eletrodos rotativos é muito conveniente,

pois pode-se variar de maneira controlada o coeficiente de transporte

de massa variando-se a velocidade de rotação do eletrodo.

Em termos analíticos, onde se deseja maximizar o sinal de corrente

e manter uma relação linear com a concentração do substrato, o

sistema ideal seria aquele para o qual a reação mediada ocorresse de

maneira uniforme no interior do filme68. Esta condição é obtida para

sistemas químicos em que a reação entre mediador e substrato possui

cinética moderada e para os quais não há limitação pelo transporte de

carga ou transporte de massa. Deve-se ressaltar, entretanto, que nestes

casos o dispositivo pode apresentar restrições para lidar com elevadas

taxas de material eletroativo proveniente da solução. Um exemplo

típico de sistema com esta característica consiste no processo de

oxidação anódica de nitrito em filmes de porfirinas de rutênio, cuja

investigação com eletrodo rotativo permitiu a determinação da constante

cinética da reação entre nitrito e sítios de Ru(III) eletrogerados

em potenciais suficientemente positivos70.

A modificação da superfície eletródica com compostos que facilitam

os processos de transferência eletrônica proporciona um

Figura 2. Influência da concentração da espécie eletroativa nas correntes

capacitiva (IC) e faradaica (IF em duas situações A e B)

Figura 3. Esquema simplificado das várias etapas relacionadas à redução

de um substrato (S) em um eletrodo modificado. Os índices s e f referem-se à

difusão do substrato na solução e no filme, respectivamente. D representa o

coeficiente de difusão da espécie em solução (D1) e no filme (D2), D3 referese

ao coeficiente de difusão de transporte de carga e k1 e k2 representam as

constantes cinéticas dos processos de transferência eletrônica heterogênea

e homogênea. Adaptado da ref. 69

Vol. 29, No. 6 Sensores eletroquímicos 1321

desafio importante no que diz respeito a investigações sobre composição,

estrutura molecular e morfologia. Isto se deve ao fato de

que os filmes são depositados em superficies planas e a quantidade

de material associada a uma monocamada tem um valor típico de

10-10 mol/cm2, portanto, as técnicas empregadas devem possuir alta

sensibilidade. Há artigos de revisão e textos mais aprofundados em

que se discutem fundamentos e aplicações de ferramentas espectroscópicas

na análise de superficies3,71-74. Nosso grupo tem empregado

algumas das técnicas acima relacionadas na investigação da

estrutura de filmes de óxidos de molibdênio, nos quais se depositaram

micropartículas de metais nobres, como platina, paládio e

ródio75,76. A formação de óxidos e hidróxidos de cobre também foi

averiguada empregando-se EDS (“energy dispersive spectroscopy”)

e os resultados indicaram a forte relação entre a composição dos

filmes e a atividade eletroacatalítica do processo de oxidação do

etanol com o potencial aplicado ao eletrodo de trabalho77.

Interpretações mais consolidadas sobre o significado químico do

evento observado, principalmente quando este envolve variação de

massa na interface durante o experimento, podem ser também obtidas

empregando-se a balança eletroquímica de cristal de quartzo78,79.

Esta fornece informações de natureza não-eletroquímica (variação

da massa do eletrodo via medição da freqüência de vibração do cristal

de quartzo) como, por ex., a cinética de crescimento de filmes ou

o mecanismo de transporte iônico, sem perturbar o processo eletroquímico.

Além disso, em alguns casos em que a estequiometria do

processo eletródico é bem estabelecida, é possível correlacionar em

tempo real a massa de filme eletrodepositado na superfície do eletrodo

por duas técnicas diferentes, medindo-se a variação na freqüência

e a carga. A utilidade desta técnica na investigação de processos

eletrocatalíticos foi por nós demonstrada no estudo da oxidação

anódica do etanol em eletrodos de cobre em meio alcalino80.

Considerações sobre a seletividade das determinações

Conforme já discutido, uma das grandes limitações das técnicas

eletroquímicas com finalidades analíticas tem vínculo com a carência

de seletividade das determinações. Se a esta dificuldade se adicionar a

limitação do uso contínuo do sensor em função de eventuais problemas

com envenenamento, compreende-se o enorme esforço da comunidade

eletroquímica na busca de alternativas para restringir o acesso de determinadas

espécies químicas à superfície eletródica. Neste sentido, a

estratégia convencionalmente utilizada consiste na deposição de membranas

poliméricas insolúveis em meio aquoso, que são seletivas à difusão

de compostos dissolvidos em solução por diferentes mecanismos.

Como exemplos de substâncias convencionalmente utilizadas

podem ser citados Nafion81-83, polipirrol84, polianilina85 e acetato de

celulose86. Cabe ressaltar um interessante uso de membrana de gelatina

sólida no recobrimento da superfície eletródica, que traz vantagens

adicionais relacionadas à menor influência da convecção nas medições,

uma vez que a camada protetora possui espessura relativamente

grande. Não se observou, entretanto, diminuição significativa da velocidade

de transporte do analito à superfície do eletrodo87.

O modo de atuação das membranas protetoras baseia-se essencialmente

em restrição por carga e tamanho e os polímeros mais

utilizados são acetato de celulose e Nafion. No primeiro caso excluem-

se substâncias químicas devido à dimensão das moléculas, uma

vez que a porosidade do filme pode ser controlada adequadamente

alterando-se o pH da solução e o tempo de hidrólise. Desta forma,

somente espécies relativamente pequenas têm acesso à superfície

do eletrodo (ou aos sítios catalíticos). No caso do Nafion, o controle

da passagem de espécies carregadas é efetuado devido à imobilização

de filme contendo sítios aniônicos (sulfonato) dispostos de maneira

estruturada no filme. Desta forma, o polímero depositado restringe

severamente a passagem de ânions, mas é permeável a cátions

e espécies eletricamente neutras. Na Figura 4 apresenta-se de maneira

esquemática o recobrimento de uma superfície eletródica com

vistas ao bloqueio da passagem de espécies químicas.

MEDIÇÕES EM AMBIENTES MICROSCÓPICOS

Miniaturização dos dispositivos

Seguindo uma tendência da ciência contemporânea, a miniaturização

de sistemas eletroquímicos também constitui-se em área

de fronteira das pesquisas, embora o trabalho com eletrodos de

dimensões micrométricas remonte à década de 40, quando a necessidade

de monitorar a concentração de oxigênio em organismos

vivos originou a idéia da introdução de eletrodos de platina, de

dimensões reduzidas, em tecidos e músculos88. Polarizando-se os

eletrodos em potenciais suficientemente negativos, foram obtidos

sinais de corrente proporcionais à concentração de oxigênio com a

vantagem de que as pequenas correntes oriundas do processo

faradaico não causavam danos às células.

O termo “microeletrodos” está associado à obtenção de situações

de estado estacionário em janelas de tempo muito mais curtas que as

usualmente observadas ao se trabalhar com eletrodos de dimensões

milimétricas. Há várias maneiras de se obter condições de estado estacionário

como, por ex., garantindo a contínua chegada de material

eletroativo à superfície do eletrodo por convecção forçada e controlada

(eletrodo rotativo ou com células do tipo “wall-jet”) ou pela utilização

de um segundo eletrodo de trabalho (localizado nas proximidades do

eletrodo principal), cuja função é minimizar as perdas oriundas da difusão

planar regenerando-se continuamente a espécie eletroativa

(“positive feedback effect”)89. Outra possibilidade envolve o uso de

eletrodos com geometria suficientemente apropriada para garantir um

fluxo convergente do material eletroativo, de forma a manter um fluxo

contínuo em direção ao eletrodo de trabalho. Para tanto, eletrodos que

possuem escala micrométrica em pelo menos uma de suas dimensões

são bastante eficientes, pois o tempo necessário para o atingimento do

estado estacionário (como conseqüência da difusão convergente) é tanto

menor quanto mais reduzida for esta dimensão. Desta forma, o trabalho

com microeletrodos reveste-se de importância na medida em que

se minimizam os efeitos da convecção natural, sempre presente alguns

segundos após o início dos experimentos.

O desenvolvimento contínuo da eletrônica e da indústria de precisão

tem possibilitado a construção de eletrodos com área eletroquimicamente

ativa cada vez menor, impulsionando pesquisas envolvendo

tais microelectrodos (ou ultramicroeletrodos) na área de estudos

eletroquímicos fundamentais ou na aplicação dos mesmos com

Figura 4. Diagrama esquemático da detecção de L-lactato em microeletrodo

de platina. Note a presença de diferentes camadas, que permitem a detecção

seletiva de L-lactato. Adaptado da ref. 137

1322 Lowinsohn e Bertotti Quim. Nova

finalidades analíticas. Há inúmeras revisões sobre este assunto, incluindo

métodos de fabricação e aplicações49-52,90-92. Cabe ressaltar,

entretanto, que existem demandas crescentes para o desenvolvimento

de métodos analíticos para monitoramento de espécies químicas

em micro-ambientes, particularmente no caso de amostras de elevado

custo ou nas quais o número de moléculas é muito pequeno. Análises

em nano ou até mesmo pico-litros têm sido requeridas e neste

contexto situam-se amostras de interesse biológico4,93-97. A

potencialidade analítica do uso de microeletrodos como sensores

eletroquímicos despertou o interesse na construção de dispositivos

que, além de possuírem as propriedades eletroquímicas inerentes aos

microeletrodos, pudessem ser fabricados de maneira estruturalmente

micrométrica, viabilizando o uso em ambientes microscópicos84,95.

Nestes casos, o isolamento de microfibras condutoras é feito sem o

uso de suportes relativamente volumosos, como os utilizados classicamente

(micropipetas de vidro, ponteiras de plástico, etc). Tintas

eletroforéticas, Teflon e outros materiais têm sido largamente empregados

para estes fins e há certamente inúmeras outras alternativas

que podem satisfazer as necessidades requeridas em função do tipo

de amostra, freqüência de uso e tamanho do dispositivo desejado98-100.

Objetivando a fabricação de dispositivos estruturalmente microscópicos,

temos estudado procedimentos para corrosão de

microfibras de platina e ouro (diâmetro típico de 50 μm) em que,

utilizando-se transformadores AC e soluções de trabalho apropriadas,

se obtêm extremidades “afinadas”, como as mostradas na Figura

5. Por fim, as fibras são seladas pela imersão em um

plastificante de borracha e posteriormente deixadas com a ponta

para cima até a secagem completa101.

Finalmente, deve-se destacar a importância da incorporação do

eletrodo de referência ao corpo do eletrodo de trabalho, principalmente

no caso de sistemas químicos cujo estudo requer a utilização

de dispositivos de dimensões muito pequenas. Há diversos procedimentos

descritos na literatura84,102 com vistas à fabricação de eletrodos

com estas características. O mais usual envolve a introdução de

uma microfibra dentro do suporte do eletrodo, seguida de deposição

de uma fina camada de prata por “sputtering” na camada externa.

Esse microeletrodo é, então, mergulhado em solução de HCl e

aplicando-se potencial apropriado o filme de prata é convertido em

filme de AgCl no corpo do capilar84,103,104.

Importância e considerações sobre medições em ambientes

microscópicos

A comunicação entre células é efetuada por biomoléculas, como

catecolaminas, insulina e dopamina, entre outras, e a habilidade de

monitoramento da concentração destes compostos é muito importante

em estudos fisiológicos relacionados à transmissão de sinais para o

sistema nervoso central. Como já relatado anteriormente, o uso de

sensores eletroquímicos de dimensões estruturalmente microscópicas

constitui-se em poderosa ferramenta para este tipo de estudo, em

que se deseja realizar análises em microambientes e em tempo real.

Esta característica essencial dos sensores eletroquímicos os distinguem

com vantagens comparando-se com procedimentos bem estabelecidos

na literatura em que são empregadas técnicas de extração

de amostras em regiões adjacentes à célula. Neste caso, volumes muito

pequenos (da ordem de nL ou mesmo pL) são removidos do ambiente

celular com auxílio de micropipetas para posterior análise por técnicas

analíticas convencionais, como as espectroscópicas ou de separação,

e especial atenção tem sido dada à eletroforese capilar. Ganhase

em seletividade, pois as técnicas citadas podem conduzir a informações

sobre a composição da amostra, mas perde-se em resolução

temporal e espacial105. Uma excelente revisão sobre “single-cell

analysis” foi publicada recentemente e nela podem ser encontradas

informações detalhadas sobre as metodologias usualmente empregadas

neste tipo de investigação106. Avaliações críticas sobre as vantagens

e desvantagens da análise de células individuais têm sido apresentadas

na literatura107 e como aspectos positivos considera-se a importância

da localização das moléculas na célula e a análise de comportamentos

individuais que se diluem em populações. De outro lado,

problemas vinculados à representatividade dos resultados têm sido

apontados, assim como o fato de que informações diferentes podem

ser obtidas não como resultado do comportamento da célula, mas sim

dos diferentes estágios do processo de divisão.

A possibilidade de mapear o microambiente vizinho à célula

constitui-se na grande vantagem dos sensores amperométricos neste

tipo de estudo108. Uma das características necessárias do sensor

empregado é a elevada resolução espacial em escala tridimesional

e, para tanto, a fabricação de dispositivos com geometria microscópica

é essencial. O tempo de resposta do dispositivo deve ser muito

baixo, para que os dados sobre os eventos possam ser adquiridos

em tempo real, e tanto a seletividade como a sensibilidade das determinações

devem ser suficientemente altas, para que os sinais

medidos tenham perfeita correlação com as informações desejadas.

Um aspecto a ser considerado no uso de sensores eletroquímicos

para obtenção de informações sobre a liberação de biomoléculas

em ambientes celulares diz respeito à eventual distribuição nãouniforme

da espécie química de interesse no espaço amostrado. Diferentemente

de medições realizadas em meio homogêneo, nestes

casos cria-se um gradiente de concentração, de forma que o significado

da medição efetuada em um ponto muito específico do ambiente

celular deve ser analisado com cuidado. Este efeito é tanto

mais pronunciado quanto menor for a distância entre a fonte emissora

da biomolécula e a extremidade do sensor, razão pela qual a

resposta do dispositivo deve ser muito rápida para monitorar com

resolução as variações na composição do microambiente.

Outro detalhe a ser considerado durante medições em amostras

de dimensões reduzidas tem relação com a perturbação no sistema

ocasionada pela eletrólise. Nestas situações, em que o número de

moléculas é extremamente pequeno, as modificações na composição

da solução podem ser significativas, tanto pela remoção do analito

estudado, como também pela introdução de novas espécies químicas

resultantes do processo eletródico. Estudos têm sido realizados com

intuito de avaliar a extensão da eletrólise nestes microambientes,

tipicamente da ordem de alguns pL, e de fazer comparações com

processos similares conduzidos em condições convencionais (volumes

não restritos). As perdas por evaporação são minimizadas pelo

recobrimento da solução aquosa com óleos minerais ou acondicionamento

da amostra em “microvials” ou reservatórios especialmente

fabricados por litografia93-95,97. Estas estratégias são bastante úteis

quando se deseja monitorar a concentração total da espécie liberada

durante um evento no ambiente celular e, visto que as moléculas

Figura 5. Foto de um microeletrodo de ouro resultante do procedimento de

corrosão da fibra utilizando transformadores AC e soluções apropriadas

(ver ref. 97 para maiores detalhes)

Vol. 29, No. 6 Sensores eletroquímicos 1323

podem ser mantidas em volumes muito reduzidos, pode-se trabalhar

com concentrações relativamente altas.

Determinações amperométricas in vivo de espécies químicas

de importância biológica

Conforme já frisado em seção anterior, o emprego de sensores

eletroquímicos para monitoramento da concentração de moléculas de

relevância biológica tem sido objeto de investigações crescentes e profícuas

em Eletroanalítica, motivadas especialmente pela versatilidade

dos procedimentos associados à técnica. Uma das espécies mais estudadas

consiste no óxido nítrico (NO), molécula reconhecida como mensageiro

celular no corpo humano. O papel do NO na evolução de diversas

doenças relacionadas ao coração e à impotência sexual tem motivado

estudos sobre comportamento bioquímico e propriedades terapêuticas.

A rápida difusão da molécula do centro gerador ao sítio de atuação

e a elevada reatividade química justificam o desenvolvimento de dispositivos

confiáveis, precisos, sensíveis e de resposta rápida para

viabilizar a compreensão dos mecanismos de atuação do NO.

O desenvolvimento de sensores eletroquímicos para medições

de NO in vivo remonta ao início da década de 90, quando foram

publicados os primeiros trabalhos que nortearam o princípio de fabricação

de sensores comercias para NO. Estes baseiam-se no

recobrimento de microeletrodos de platina com filmes eletropolimerizados

de porfirinas de níquel109,110. O papel destes filmes

envolve processo eletrocatalítico de oxidação do NO e na presença

de membranas de Nafion restringe-se a oxidação de espécies

aniônicas presentes nos fluidos biológicos como, por ex., ascorbato.

Algumas revisões sobre o assunto podem ser encontradas na literatura111-

115, assim como exemplos de recentes aplicações destes

sensores eletroquímicos para monitoramento de NO em amostras

biológicas114,116-119. Nossas contribuições nesta área envolveram estudos

sobre a codeposição de complexos de rutênio e óxidos de

molibdênio em microeletrodos de ouro e pôde-se constatar a viabilidade

do uso do dispositivo no monitoramento da variação da concentração

de NO liberado em reação química envolvendo

peroxonitrito e tempol em meio de bicarbonato120.

Pode-se constatar a importância do uso de microeletrodos como

sensores para neurotransmissores121 em nível celular pelos inúmeros

trabalhados publicados recentemente na literatura. Compostos

como glutamato122, catecolaminas123,124, dopamina125-127, serotonina124,127,

entre outros, têm sido determinados com seletividade,

sensibilidade e tempo de resposta adequados, fornecendo subsídios

para melhor compreensão dos processos de transmissão de informações

entre células nervosas.

O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do cérebro

de mamíferos e em altas quantidades pode causar desordens

neurológicas, incluindo esquizofrenia, doença de Parkinson, derrame

e epilepsia. Portanto, sensores capazes de monitorar a liberação

desta espécie química em tempo real podem contribuir para melhor

entendimento dos estados fisiológico e patológico induzidos pelo

glutamato no sistema nervoso central. Quanto à determinação de

glutamato in vivo, há uma grande quantidade de trabalhos recentes

relatados na literatura122,128-130.

Algumas purinas, tais como ATP e adenosina, também são de grande

importância biológica por serem indicativos de distúrbios neurológicos.

Por esta razão, um aumento crescente no número de artigos publicados

na literatura envolvendo a fabricação de microeletrodos para

determinação destas purinas em tempo real tem sido evidenciado131-133.

Outros compostos gerados como respostas a estímulos às células

também têm sido determinados com sensores eletroquímicos e,

dentre eles, podem-se citar peróxido de hidrogênio134, lactato135-137 e

superóxidos138,139. A possibilidade de monitoramento de mais de um

composto na superfície do cérebro com um dispositivo único constituído

por conjunto de microeletrodos de disco separados foi discutida

por Michael e colaboradores125. A seletividade das respostas

obtidas para glutamato, glicose e colina foi demonstrada em trabalho

em que enzimas são suportadas na superfície de microletrodos

de fibra de carbono com auxílio de filmes poliméricos123. Propostas

para determinação simultânea de catecolaminas e serotonina124

ou serotonina e dopamina127 também são encontradas na literatura.

O lactato é conhecido como um dos mais importantes metabólitos

em análise clínica e consiste em indicador de choques, insuficiência

respiratória, doenças cardíacas e desordem metabólica. Os níveis

de lactato podem também ser associados a problemas nos tecidos,

à trombose e às condições físicas de animais e atletas. Por este

motivo, novas tecnologias para dosagem do lactato vêm sendo estudadas

em conjunto com testes laboratoriais realizados fora do ambiente

clínico convencional, testes estes chamados de “point-ofcare

testing”140. Viabiliza-se, desta maneira, a dosagem da concentração

sanguínea do lactato em campo, de forma precisa e com uma

pequena gota de sangue obtida da ponta de um dos dedos do atleta.

Como o resultado é obtido em poucos minutos, a realização do teste,

a interpretação dos resultados e a tomada de decisões são facilitadas,

ampliando o uso do indicador na Medicina Esportiva.

PERSPECTIVAS E DESAFIOS

A viabilidade tecnológica da fabricação de microeletrodos com

extremidades muito finas, com dimensões sub-micrométricas, tem

alargado o uso da técnica SECM (“scanning electrochemical

microscopy”) no estudo de sistemas celulares141. A elevada resolução

espacial da técnica oriunda da dimensão reduzida do eletrodo,

associada à rapidez das respostas obtidas em condições de estado

estacionário, permite a obtenção de informações sobre a concentração

em uma escala tridimensional. Obtêm-se, portanto, mapas topográficos

do sistema químico. A técnica também possibilita a geração

eletroquímica de espécies químicas em regiões muito específicas,

dando ensejo a experimentos sobre a reatividade de moléculas

em localidades definidas da célula. Finalmente, cabe ressaltar a

importância de se operar no modo “positive feedback”89,142, uma

vez que se pode encapsular um pequeno número de moléculas em

um ambiente muito restrito. Como a espécie eletroativa pode ser

continuamente regenerada no microeletrodo, localizado muito próximo

do substrato, mesmo que o número de moléculas seja pequeno

podem-se obter correntes mensuráveis142,143.

Embora existam vantagens indiscutíveis no uso de sensores

eletroquímicos, alguns aspectos ainda estão no limiar de soluções

plausíveis quando se pensa em termos “realmente práticos”. Um dos

desafios para os quais já existem pesquisas em andamento refere-se,

por ex., à implantação de sensores no corpo humano144. Esta possibilidade

é altamente atraente pois eliminam-se as desvantagens dos

procedimentos invasivos muito freqüentes que, mesmo para volumes

pequenos de amostra, causam inconvenientes. O exemplo mais próximo

da vida cotidiana envolve medições do nível de glicose no sangue,

para as já quais existem sensores amperométricos comerciais145.

Entretanto, quando implantados no tecido humano, é de se esperar

uma pronta resposta do organismo contra a “invasão”, resultando no

desenvolvimento de camadas protetoras que tendem a isolar o dispositivo

do ambiente celular. Outros ítens a serem considerados relacionam-

se à necessidade de recarregamento da bateria do sensor, à

eventual recalibração periódica e à biocompatibilidade dos materiais

empregados. Trata-se, portanto, de aspectos de ordem prática que

vão requerer investigações aprofundadas para consecução das metas

desejadas, ou seja, dispositivos operando a baixo custo e com autonomia

suficientemente prolongada para garantir o longo uso.

1324 Lowinsohn e Bertotti Quim. Nova

Ressalte-se ainda que sistemas miniaturizados de monitoramento

constituem-se em ferramenta para coleta e transmissão de

dados sobre a saúde de pacientes em ambientes domiciliares ou no

trabalho, facilitando a predição de doenças e o possível diagnóstico.

Como conseqüência, consultas face a face podem ser reduzidas,

assim como as estadas em hospitais. Essa tecnologia, denominada

telemetria, também pode contribuir para otimização dos recursos

destinados à prevenção de doenças, principalmente em ambientes

rurais. Trabalhos envolvendo o uso de sistemas telemétricos

implantados para monitoramento de atividades neurais146, nível de

oxigênio no sangue e freqüências cardíaca e respiratória147 e

arritmias148 já estão relatados na literatura.

Em resumo, o futuro da área de pesquisas sobre sensores

eletroquímicos, especialmente aqueles destinados ao uso com fins de

monitoramento em sistema biológicos, certamente vai envolver o conceito

de interdisciplinaridade. A preparação de novos polímeros e

matrizes hospedeiras aos quais se alojam catalisadores eficientes consiste

em área onde químicos de diferentes especialidades podem atuar

e, neste sentido, são relevantes não só pesquisas aplicadas mas

também aquelas de cunho fundamental. A imobilização do material

em eletrodos de dimensões nano ou micrométricas necessita de estudos

contínuos na área de novos materiais e nanotecnologia. Investigações

e novos desenvolvimentos relacionados ao uso do sensor

eletroquímico no monitoramento de metabólitos de reações

enzimáticas ou substâncias de interesse bioquímico podem ser de

valia tanto para profissionais ligados à área de Química, como também

para aqueles ligados às áreas biológicas. A construção de dispositivos

portáteis e a recepção e transmissão fidedigna de dados a longas

distâncias (telemetria) vai depender da interação com engenheiros.

Conclui-se, portanto, que a linha de pesquisa envolvendo sensores

eletroquímicos vai suplantar em um futuro próximo as fronteiras da

academia e atrair a atenção das áreas tecnológicas e comerciais, demonstrando

a importância deste ramo da ciência para a melhoria das

condições de vida em nossa sociedade.

AGRADECIMENTOS

À FAPESP, CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro concedido

na forma de bolsas e para o financiamento das pesquisas.

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