Importância da cromatografia

Cromatografia

Histórico

Foi o botânico russo, Mikhail Semenovich Tswett quem inventou a primeira técnica cromatográfica em 1900 durante suas pesquisas sobre a clorofila. Ele usou uma coluna de absorção líquida contendo carbonato de cálciopara separar pigmentos de folhas de plantas. O método foi descrito em 30 de dezembro de 1901 no 11° Congresso de Médicos e Naturalistas em São Petersburgo. A primeira publicação feita foi em 1903. Ele usou pela primeira vez o termo cromatografia em uma publicação em 1906 no jornal de botânica alemão, Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft. Em 1907, demonstrou sua cromatografia para a Sociedade Botânica Alemã.

Depois de Tswett, muitos cientistas fizeram substanciais contribuições para o avanço da teoria e da prática da cromatografia e estima-se que atualmente cerca de 60% das análises feitas no mundo envolvem a cromatografia.

Definição

Cromatografia é um método físico-químico de separação, no qual os compostos presentes em uma mistura são distribuídos entre uma fase estacionária e uma fase móvel. A separação ocorre porque os compostos têm diferentes afinidades com a fase estacionária e com a fase móvel, portanto deslocam-se com diferentes velocidades.

• Fase móvel: solvente ( gás ou liquido ) que se move através do sistema (coluna ou placa), carregando os solutos;

• Fase estacionária: sólido (ou liquido impreginado em um sólido) que permanece fixo no sistema ( coluna ou placa).

Importância da cromatografia

A cromatografia é uma poderosa ferramenta analítica para o controle de qualidade de ativos e formas farmacêuticas. Apresenta elevada exatidão nos resultados, permitindo a identificação e/ou a quantificação dos compostos presentes com confiabilidade. “A cromatografia atua em várias áreas de atribuição do controle, como na determinação da porcentagem do princípio ativo, na quantificação das impurezas de um produto, na determinação da composição ou formulação de um produto, e também no estudo de estabilidade e degradação de um produto. Desta forma, o controle de qualidade se beneficia ao usar uma técnica que permite obter resultados em curto espaço de tempo (em geral, 1 a 20 minutos) e com alta precisão e exatidão”, resume Romão Batista Beserra Jr., especialista em cromatografia da Agilent. “Outro ponto importante a se destacar é a praticidade de execução dessas análises, ajudadas também pelo avanço dos softwares que são utilizados nesses equipamentos”, acrescenta José Lamartine Soares Sobrinho, diretor do Núcleo de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal do Piauí (UFPI).

Determinação do melhor sistema de solventes para separação de uma mistura

• Deve-se fazer uma série de placas por CCD em sistemas de diferentes polaridades com a mistura a ser separada;

• O melhor sistema é aquele que de um valor de Rf na faixa de 0.25-0.35 para o componente mais rápido na placa;

Principais tipos de cromatografia

• Cromatografia em camada fina (TLC)

A cromatografia em camada fina é uma técnica simples, barata e muito importante para a separação rápida e análise quantitativa de pequenas quantidades de material. Ela é usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes em uma mistura comparando-os com padrões; acompanhar o curso de uma reação pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma mistura.

Na cromatografia de camada fina a fase líquida ascende por uma camada fina do adsorvente estendida sobre um suporte. O suporte mais típico é uma placa de vidro (outros materiais podem ser usados).

Sobre a placa espalha-se uma camada fina de adsorvente suspenso em água (ou outro solvente) e deixa-se secar. A placa coberta e seca chama-se "placa de camada fina". Quando a placa de camada fina é colocada verticalmente em um recipiente fechado (cuba cromatográfica) que contém uma pequena quantidade de solvente, este eluirá pela camada do adsorvente por ação capilar.

A amostra é colocada na parte inferior da placa, através de aplicações sucessivas de uma solução da amostra com um pequeno capilar. Deve-se formar uma pequena mancha circular. À medida que o solvente sobe pela placa, a amostra é compartilhada entre a fase líquida móvel e a fase sólida estacionária. Durante este processo, os diversos componentes da mistura são separados. Na cromatografia, as substâncias menos polares avançam mais rapidamente que as substâncias mais polares. Esta diferença na velocidade resultará em uma separação dos componentes da amostra. Quando estiverem presentes várias substâncias, cada uma se comportará segundo suas propriedades de solubilidade e adsorção, dependendo dos grupos funcionais presentes na sua estrutura.

Depois que o solvente ascendeu pela placa, esta é retirada da cuba e seca até que esteja livre do solvente. Cada mancha corresponde a um componente separado na mistura original. Se os componentes são substâncias coloridas, as diversas manchas serão claramente visíveis. Contudo, é bastante comum que as manchas sejam invisíveis porque correspondem a compostos incolores. Para a visualização deve-se "revelar a placa". Um método bastante comum é o uso de vapores de iodo, que reage com muitos compostos orgânicos formando complexos de cor café ou amarela. Outros reagentes para visualização são: nitrato de prata (para derivados halogenados), 2,4-dinitrofenilidrazina (para cetonas e aldeídos), verde de bromocresol (para ácidos), ninhidrina (para aminoácidos), etc.

Um parâmetro freqüentemente usado em cromatografia é o "índice de retenção" de um composto (Rf). Na cromatografia de camada fina, o Rf é função do tipo de suporte (fase fixa) empregado e do eluente. Ele é definido como a razão entre a distância percorrida pela mancha do componente e a distância percorrida pelo eluente.

Portanto: Rf = dc / ds

Onde: dc = distância percorrida pelos componentes da mistura.

ds = distância percorrida pelo eluente.

Quando as condições de medida forem completamente especificadas, o valor de Rf é constante para qualquer composto dado e correspondente a uma propriedade física. Este valor deve apenas ser tomado como guia,