O Cromatografia

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Consiste na separação dos componentes de uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de fase estacionária retida sobre uma superfície plana.

Vantagens:

• Fácil compreensão e execução
• Rapidez
• Versatilidade
• Grande reprodutibilidade
• Baixo custo

Aplicações da CCD:

• Comparativa ou analítica (camadas de 0,25 mm)
• Preparativa (camadas de 0,5 a 1 mm)

Mecanismo de separação:

• Principalmente adsorção
• Partição  e troca iônica

Tipos de substâncias analisadas por CCD:

• Separação de substâncias hidrofóbicas: aldeídos, cetonas, fenóis, ácidos graxos, alcalóides terpenóides e esteróides
• Hidrofílicas: aminoácidos (placas desativada com vapor d' água ou eluente contendo água, mecanismo de separação semelhante ao da cromatografia em papel)

Adsorventes:

• Sílica, alumina, celulose e poliamida (mais usados)
• Outros:
• uréia e polietileno (separar ácidos graxos)
• silicato de cálcio ou magnésio (separar açúcares)
• gel de dextrana (separar aminoácidos e proteínas)
• carvão ativado (separar fenóis)

Sílica (SiO2) - ácido silício amorfo

• Mais usado (cromatografia por adsorção)
• Altamente poroso
• Cárater fracamente ácido (pode conduzir a reações ácido-catalizadas das amostras formando artefatos)
• Polar (fase normal)

FASE REVERSA: pode ser preparada a partir de sílica gel (Woelm, 32-63 μm) com n-octadeciltriclorosilano, pelo método de Evans et al., 1980.

PREPARAÇÃO DA FASE REVERSA

[pic 1]

Fase reversa versus fase normal

	Fase reversa	Fase normal
Polaridade da fase estacionária	Baixa	Alta
Polaridade da amostra	Apolar	Polar
Força de eluição	MeOH diminui	MeOH aumenta
Ordem de eluição	Mais polar 1o	Menos polar 1o

Simbologia utilizada na sílica produzida pela Merck

• G:  contém aglutinantes (10-15% de gesso, ou 1-3% de amido ou talco)
• H:  não contém aglutinates
• P:  para uso em camada preparativa
• F:  indica a presença de  substâncias fluorescentes (indicação do comprimento de onda  da excitação da substância incorporada). Exemplo: PF254; PF366; PF254+366 ; GF

Preparação das placas

• 25 g de sílica + 50-60 mL de água
• 5 placas de 20x20 cm com espessura da camada de 0,25 mm

Observação: existem disponíveis placas pré-fabricadas.

Aplicação da suspensão de sílica nas placas

• Manualmente
• Com espalhadores (manuais e automáticos)

Placas: lavadas com detergente, solução sulfocrômica, água corrente e secas em estufa. Para eliminar toda gordura, recomenda-se passar na placa depois de seca,  um chumaço de algodão embebido em acetona ou hexano.

Após  a aplicação da camada de adsorvente sobre a placa, ela é seca ao ar livre. Quando a superfície ficar opaca, dependendo da finalidade, coloca-se para ativar.

Ativação das placas

        Sílica e alumina: 105-110 oC por 30 a 60 minutos

Seleção da fase móvel

• Depende da natureza química das substâncias a serem separadas (origem da amostra)
• Solvente ou mistura de solventes
• Toma-se como base a série eluotrópica dos solventes

Série eluotrópica -  ordenação dos solventes com base em suas polaridades, as quais estão diretamente relacionadas com o poder de eluição.

Série eluotrópica, em ordem crescente de polaridade*

Solvente

Hexano

Éter de petróleo

Ciclo-hexano

Tetracloreto de cabono

Benzeno

Tolueno

Diclorometano

Clorofórmio

Éer etílico

Acetato de etila

Piridina

Acetona

Etanol

Metanol

Ácido acético

Algumas fases móveis ordenadas em função de suas polaridades

Solvente	Solubilidade em água g/100 mL	Constante dielétrica (20 oC)
Éter de petróleo (30-60 oC	imiscível	1,84
Hexano	imiscível	1,88
Benzeno	0,08	2,29
Éter etílico	7,5	4,34
Clorofórmio	0,82	4,80
Acetato de etila	8,6	6,02
Diclorometano	0,6	10,40
Butan-2-ol	12,5	17,80
Acetona	miscível	21,50
Etanol	miscível	24,60
Metanol	miscível	33,60
Água	miscível	80,40

Aplicação das amostras em cromatoplacas (analíticas)

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