O RELATÓRIO DE BIOQUÍMICA

RELATÓRIO DE BIOQUÍMICA

1. Introdução

Uma proteína com forte ação anticancerígena foi isolada das raízes de uma planta da Amazônia. Essa proteína é um peptídeo de 20 aminoácidos, chamado de PEP10. Os pesquisadores querem produzir esse peptídeo em bactérias, para a produção de um medicamento anti-câncer.

Para tanto, os pesquisadores amplificaram o gene da planta que codifica o peptídeo por PCR (reação em cadeia da polimerase); ligaram o produto de PCR ao vetor plasmidial pDEST15 para expressão em bactéria e, em seguida, inseriram o resultante em células viáveis de bactéria Escherichia coli DH5-α através de transformação. Esse plasmídeo Pdest15 tem o gene que confere resistência ao antibiótico ampicilina.

Tendo isso posto, no estudo prático I foi feita a extração do DNA plasmidial de Escherichia coli para confirmar a presença do gene que codifica o peptídeo PEP10, e no estudo prático II, foi realizada a extração de proteínas totais (PEP10), contendo o plasmídeo recombinante PDEST15 + PEP10 para visualizar se estava ocorrendo a expressão do PEP10 nas bactérias.

Para a extração do DNA plasmidial utilizou-se o procedimento de lise alcalina. Este método é bem simples e apresenta bons resultados qualitativos e quantitativos sob diversas condições. Baseia-se na diferença da desnaturação, em condições alcalinas, entre o DNA plasmidial circular e o DNA cromossômico de alto peso molecular.

Após a separação do DNA plasmidial, realizou-se a eletroforese em gel de agarose para confirmar a presença do gene que codifica o PEP10. Esta técnica é aplicada para a visualização dos fragmentos de DNA, após sua extração. Ela é utilizada para separar, identificar e isolar os fragmentos de DNA a partir da influência de um campo elétrico aplicado, que faz os fragmentos migrarem através de uma malha de gel, de um polo a outro. Como os fragmentos de DNA apresentam aproximadamente a mesma carga, o gel possibilita a separação de acordo com o tamanho dos fragmentos de DNA. Os fragmentos migram pela malha a uma velocidade inversamente proporcional ao seu tamanho.

Na técnica de SDS-PAGE utilizada para verificar a expressão do peptídio PEP10 nas bactérias, as variáveis forma e carga nativa das proteínas precisaram ser eliminadas para que a separação dependesse apenas de sua massa molecular. O SDS teve um papel fundamente neste processo. Trata-se de um detergente anfipático cuja função é desnaturar as proteínas, ou seja, destruir a estrutura tridimensional, e conferir uma densidade de carga uniforme. Apresenta alta carga negativa e uma cauda hidrofóbica que interage com as cadeias polipeptídica, tornando-as negativamente carregadas.

1. Objetivos

Na aula prática I, realizou-se a extração do DNA plasmidial de uma colônia de bactéria E.coli, que cresceu (previamente) em meio com o antibiótico ampicilina, para confirmar que ela contém o gene que codifica o peptídeo PEP10. As bactérias foram chamadas de E.coli (PEP10).

Na aula prática II, realizou-se a extração de proteínas totais de E.coli (PEP10) contendo o plasmídeo recombinante Pdest15 + PEP10, para visualizar se estava ocorrendo a expressão do peptídeo PEP10 nessas bactérias.

1. Metodologia

Na aula prática I, após a inoculação prévia de bactéria E.coli em 5ml de meio de cultura LB estéril contendo 100µL de ampicilina a 37°C, 150rpm, overnight.

1. Extração de DNA plasmidial

1. Transferiu-se com pipeta 1,5ml da cultura bacteriana para um tubo de 1,5mL. Centrifugou-se a 5000rpm por 1 min e descartou-se o sobrenadante.
2. Repetiu-se a etapa 1, utilizando o mesmo tubo.
3. Adicionou-se 100µL da Solução 1 (50Mm de glicose, 25Mm de Tris-HCl pH 8.0, 10Mm de EDTA Ph 8.0). Ressuspendeu-se as células gentilmente por pipetagem e incube a temperatura ambiente por 5 min.
4. Adicionou-se 200µL da Solução 2 (200Mm de NaOH e 1% de SDS). Agitou-se o tubo por inversão suave (5 vezes) e incubou-se  a temperatura ambiente por 5 min. Nesta etapa, ao abrir o tubo, visualizou-se  a solução viscosa.
5. Adicionou-se, imediatamente, 150µL da Solução 3 (5M de acetato de potássio Ph 4,8). Agitou-se o tubo por inversão suave (5 vezes) e incubou-se no gelo por 5 min. Neste estapa formou-se um aglomerado branco.
6. Centrigugou-se a 13.000rpm por 5 min e transferiu-se o sobrenadante para outro tubo. Observou-se com atenção para não coletar o material na interface das soluções.
7. Adicionou-se 400µL de isopropanol. Agitou-se o tubo por inversão suave (5 a 10 vezes).
8. Centrifugou-se a 13.000rpm por 15 min. Observou-se um pequeno precipitado.
9. Descartou-se o isopropanol e o tubo foi deixado aberto, invertido sobre papel, a temperatura ambiente até o DNA não apresentar mais odor de álcool (cerca de 10 min).
10. Ressuspendeu-se o DNA em 20µL de água mili-Q.
11. Estocou-se o DNA  a -20°C.

1. Eletroforese em gel de agarose

Misturou-se 5µL de DNA plasmidial e 1µL de tampão de amostra e aplicou-se a mistura em uma caneleta do gel de agarose 0,8% e tampão de corrida TAE 0.5X. Em seguida, aplicou-se a voltagem de 120V por aproximadamente 30 min.

Na aula prática II, uma colônia de E.coli (PEP10) foi inoculada em 5mL de meio de cultura LB estéril contendo 100µg/mL de ampicilina a 37°C, 150 rpm, e crescida durante a noite (esta etapa foi prepara previamente ao dia da prática). Neste grupo, a cultura de bactéria foi introduzida num tubo sem adição de IPTG. Alguns grupos adicionaram a cultura em 1Mm de IPTG, para indução do promotor T7.