Relatório-de-Bioquímica-Cinética-Enzimática

     

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Coordenadoria de Biotecnologia

Curso de Bioquímica

Prática: Cinética Enzimática

Alunos: Gabriel Fonseca, Giovanna Neri, João Pedro Martinho e

Renato Gonçalves.

Turma: QM161

Professores: Tuane e Adilson.

Data da realização da prática: 07/02/2015

Data da entrega do relatório: 28/02/2015

Avaliação:

Critério:	Nota:
Apresentação
Introdução
Objetivos
Métodos
Resultados
Discussão
Bibliografia
Total:

     

I - Introdução

        A cinética enzimática é uma área de estudos que analisa as influências de diversos fatores nas velocidades de reações de transformação de substrato em produto com atuação de enzimas. Dentre estes fatores pode-se citar a concentração do substrato e a presença ou ausência de inibidores de enzimas. Para isto, é necessário determinar-se a concentração de produto formado em diversas condições de reação, expondo os sistemas aos fatores citados.

        A determinação de concentrações desconhecidas de proteínas usualmente é feita por meio de métodos fotocolorimétricos. Os métodos fotocolorimétricos consistem na realização de reações que resultam em soluções coloridas. A intensidade da coloração destas soluções será proporcional à concentração da substância analisada.

        Porém, a intensidade das colorações nem sempre pode ser observada a olhos nus e por isto utilizam-se instrumentos como o espectrofotômetro, que mede a absorção de luz (absorvância). Com os dados da absorvância de uma solução padrão (concentração conhecida) e da solução desconhecida, é possível realizar uma regra de três para determinar a concentração desconhecida. Entretanto, são utilizados não apenas um padrão, mas sim vários, a fim de construir a chamada curva padrão e melhorar o critério de comparação de absorvâncias. Com isto, obtém-se uma concentração mais precisa.

        Analogamente a isto, é possível construir também curvas que relacionam a absorvância de uma solução em função da concentração do substrato de uma reação enzimática. Isto é, um sistema enzimático pode ser constituído e reagido diversas vezes com um tempo de reação constante e concentração de substrato variável. Com isto, é possível analizar graficamente a influência da concentração do substrato.

        Ainda na análise de sistemas enzimáticos, também é possível analisar a influência de inibidores na velocidade das reações de transformação de substrato em produto. Os inibidores são moléculas capazes de interferir na catálise enzimática, tornando-a menos eficaz. Estes podem agir de diversas formas, podendo ser reversíveis ou então irreversíveis. O papel destes inibidores muitas vezes é atuar no organismo a fim de impedir a ação de determinada enzima com fins medicinais.

III - Material e métodos

III. A. Material

- Solução padrão de p-nitrofenol (PNP) 0,1 mM em tampão tris-HCl pH 9,5.

- Solução de p-nitro-fenil-fosfato (PNPP) 1 mM em tampão tris-HCl pH 9,5

- Solução tampão tris-HCl pH 9,5.

- Solução de NaOH 2M.

- Solução de enzima: fosfatase alcalina.

- Inibidor

-Tubos de ensaio.

- Placa de 96 poços para leitor de Elisa.

- Pipetador automático 20-100 µL.

- Pipetador automático 200-1000 µL.

- Leitor de Elisa.

III. B. Métodos

a) Construção da curva padrão de PNP

Foram transferidas, com auxílio de pipeta automática, alíquotas das soluções indicadas para tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo:

Tubo nº	Solução padrão de PNP (µL)	Tampão Tris-HCl pH 9,5 (µL)	Solução de NaOH 2M (µL)
B	0	800	200
1	75	725	200
2	150	650	200
3	225	575	200
4	300	500	200
5	375	425	200
6	450	350	200
7	525	275	200

        Os tubos foram manualmente homogeneizados e após isto foram transferidos 200 µL de cada tubo para uma placa de 96 poços para leitura em 405 nm.

b) Curva de substrato

        Foram transferidas, com auxílio de pipeta automática, alíquotas das soluções indicadas para os tubos de ensaio devidamente rotulados segundo a tabela abaixo, exceto a solução de enzima e de NaOH.