Relatorio de bioquímica e suas estruturas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE RORAIMA

CENTRO DE ESTUDOS DA BIODIVERSIDADE

DISCIPLINA: Bioquímica

PROFª DR Pablo Oscar Amézaga Acosta

RELATÓRIO PRÁTICO

ESPECTRO DE ABSORÇÃO, CURVA DE CALIBRAÇÃO E DETERMINÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS ESPECTRO VISIVEL - METODO DE BIURETO E METODO DE ABSORÇAÕ NO ULTRAVIOLETA.

Boa Vista-RR

2015

ALAN CLAUDIO FIDELIS RAPOSO

DENISE PINTO BUENO

KAROLINE SILVA DE LIMA

RELATÓRIO PRÁTICO

ESPECTRO DE ABSORÇÃO,CURVA DE CALIBRAÇÃO E DETERMINÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS ESPECTRO VISIVEL - METODO DE BIURETO E METODO DE ABSORÇAÕ NO ULTRAVIOLETA

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Boa Vista- RR

2015

ESPECTRO VISÍVEL – METÓDO DO BIURETO

PROBLEMA

Recebemos uma solução problema de proteína para determinar a concentração de proteínas utilizando o método do biureto.  baseia-se no dosamento de complexos purpura formados em soluções alcalinas pela complexação de Cu²+ com duas ou mais ligações peptídicas e exibe um máximo de absorção de radiações com o comprimento de onda de 550nm.

INTRODUÇÃO

Os métodos espectroscópicos baseiam-se na absorção e/ ou emissão de radiação electromagnética por muitas moléculas, quando os seus electrões se movimentam entre níveis energéticos. A espectrofotometria baseia-se na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. A chamada radiação luminosa corresponde a uma gama de comprimentos de onda que vai desde o ultravioleta ate o infravermelho no espectro da radiação electromagnética. O espectro do visível está contido essencialmente na zona entre 400 e 800 µm.

Um espectrofotómetro é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda. Pode-se assim fazer passar através da amostra um feixe de luz monocromática (de um único comprimento de onda, ou quase). O espectrofotómetro permite-nos saber a quantidade de luz que é absorvida em cada comprimento de onda.

O conjunto das absorbâncias dos vários comprimentos de onda para um composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância, a espectrofotometria permite-nos, por exemplo, identificar substâncias com base no seu espectro como também quantificá-las, uma vez que a quantidade de luz absorvida está relacionada com a concentração da substância.

Existem então princípios de absorção da luz:

• A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for à solução por ela atravessada;
• A absorção da luz é tanto maior quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através das amostras  .

As características físico-químicas das proteínas exploradas em análises quantitativas são:

• As absorvências das cadeias laterais de resíduos aromáticos a 280 nm
• Absorvências específicas de grupos prostéticos de proteínas, por exemplo, do grupo heme a 415µm;
• A ligação peptídica que forma um complexo violeta com Cu2+ na reação do Biureto;
• As cadeias laterais de Tyr e Trp, que reagem com agentes oxidantes no métodode Lowry;
• A ligação de corantes a regiões hidrofóbicas, como no método de Bradford;

Cada método é aplicável a gamas restritos de concentrações de proteínas e apresentam sensibilidades e interferências a considerar, quando a amostra contém outras moléculas para além das proteínas. Utilizaremos dois métodos para se determinar a concentração da nossa solução problema à na primeira pratica foi utilizado o método de absorção no espectro visível (método do biureto), por outro lado na segunda pratica utilizamos o método de absorção no ultravioleta.

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1. PARTE EXPERIMENTAL

1.2 Materiais e Métodos

• Solução padrão
• Solução de proteína de concentração desconhecida
• Reagente Biureto:
• Espectrofotómetro
• Microcubetas para medição no visível (vidro)
• Tubos de ensaios
• Pipetas
• Ponteiras

1.  Procedimentos

1..1 Espectro de absorção

Fez-se necessário o conhecimento do cumprimento de onda onde a proteína apresentava sua máxima absorção, para este procedimento utilizou-se um tubo que funcionou como branco que cotiam o reagente biureto, este foi empregado para regular o autozero do aparelho, foi transferido 1.0 ml da solução padrão a um tubo de ensaio e adicionado 500 microlitros do reagente biureto.

Com auxilio do espectrofotômetro, as amostra contida nas microcubetas de vidro foram submetidas uma a uma aos comprimentos de onda de 450, 500, 540, 600 e 650 nm, para verificação da sua respectiva absorbância, tendo a cautela de sempre zerar o parelho com o branco (reagente biureto) a cada comprimento de onda a qual amostra foi submetida.

(nm)	Transmitância T( )[pic 3]	Absorbância D.O ou Abs
450	66.1	0.179
500	34.1	0.467
540	21.7	0.664
600	33.3	0.478
650	70.4	0.152

1.2 Após temos os resultados realizamos a curva de calibração (demonstração da lei de Lambert – beer e limite de linearidade).o gráfico  vem anexo (gráfico 1).

1.3 Para a Determinação da concentração de proteínas totais da nossa solução problema de numero 4 .Partimos  da solução stock de 200mg/dl de proteínas e empregando água destilada para diluição, foram preparados em três microtubulos 100 microlitros de  soluções padrão ,com concentrações que varia de 16 e 160 mg/ml.