Relatório n°2: Reações de precipitação de proteínas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO

CENTRO UNIVERSITÁRIO NORTE DO ESPÍRITO SANTO

Relatório n°2: Reações de precipitação de proteínas

1. RESUMO

As variações no meio em que está à proteína podem afetar sua solubilidade e sua estrutura. Variações estas como, extremos de pH, a adição de certos solventes orgânicos miscíveis em água ou certos solutos levam a desnaturação da proteína. Dessa forma, o procedimento a seguir se propõe a verificar tanto a solubilidade quanto a mudança na estrutura das proteínas.  Para isso utilizou-se solventes orgânicos, soluções salinas concentradas e solução de ácidos fortes. O presente trabalho também aborda a caracterização e a quantificação de proteínas em matérias biológicas, utilizando de métodos experimentais como: reação do biureto; reação com acetato de chumbo; reação xantoproteica e a quantificação da caseína (proteína encontrada no leite) por técnica de espectroscopia e a determinou-se o seu pI através de precipitações realizadas com ácido acético. 

1. INTRODUÇÃO

As proteínas são polímeros de aminoácidos unidos por ligações, denominadas ligações peptídicas, uma ligação peptídica é a união do grupo amino (-NH2) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminoácido, através da formação de uma amida. Para tornar a reação mais favorável, o grupo carboxila deve ser quimicamente modificado ou ativado de forma que o grupo hidroxila possa ser mais facilmente eliminado. Quando poucos aminoácidos são unidos dessa maneira, a estrutura é chamada de oligopeptídio, e quando muitos aminoácidos são unidos o produto é chamado de um polipeptídio Além disso, os diferentes grupamentos "R" encontrados nos aminoácidos influenciam na estrutura, na funcionalidade e nas propriedades das proteínas individuais4.

O comportamento ácido-base de um peptídeo pode ser predito a partir dos seus grupos α-amino e α-carboxila, bem como da natureza e numero dos seus grupos R ionizáveis. Da mesma forma que os aminoácidos livres, os peptídeos possuem curvas de titulação características e um pH isoeletronico (pI) onde eles se movem em um campo elétrico. O ponto isoelétrico (pI) de uma molécula é o pH ao qual essa molécula é eletricamente neutra. Este conceito é aplicado particularmente a aminoácidos e proteínas. O ponto isoelétrico não é o pH em que todas os grupos básicos estão desprotonados e os ácidos protonados, mas o pH em que a carga líquida da molécula é igual a zero. Em um pH abaixo do valor de pI, os aminoácidos e proteínas apresentam carga líquida positiva. Em um valor de pH acima do pI, os aminoácidos e proteínas encontram-se com carga líquida negativa6.

Cada proteína possui uma função estrutural e química especifica, sugerindo fortemente que cada uma tenha estrutura tridimensional única. A estrutura tridimensional de uma proteína e determinada pela sequência de aminoácidos, que reflete sua função, carga elétrica, massa molar, solubilidade e afinidade por certos compostos4.

Quatro níveis de estruturas proteicas são definidos: estrutura primaria unindo resíduos de aminoácidos em uma cadeia polipeptídica; estrutura secundaria que se refere a arranjos particularmente estáveis de resíduos de aminoácidos dando origem a padrões estruturais recorrentes; a estrutura terciaria descreve todos os aspectos do enovelamento tridimensional de um polipeptídio. Ha duas classes gerais de proteínas, baseadas na estrutura terciaria, as fibrosas e as globulares. Estrutura quaternária quando uma proteína possui duas ou mais subunidades polipeptídicas4.

A estrutura e a função tridimensional das proteínas podem ser destruídas pela desnaturação, demonstrando uma relação entre a estrutura e a função. A desnaturação é a modificação da estrutura tridimensional nativa da proteína, com a consequente alteração de suas propriedades. Fatores que fazem ocorrer à desnaturação são: mudanças de temperatura, mudanças de pH, adição de íons de metais pesados, adição de solventes orgânicos, e entre outros fatores. As substâncias utilizadas para a desnaturação se ligam a cadeia das proteínas e formam precipitados. Algumas proteínas desnaturadas podem renaturar-se espontaneamente para formar proteínas biologicamente ativas, mostrando que a estrutura terciaria das proteínas é determinada pela sequência de aminoácidos4.

Algumas reações de precipitação que ocorrem são: Precipitação por ação do calor; precipitação por adição de ácidos fortes; precipitação por adição de sais de metais pesados; precipitação ação de solventes orgânicos. As proteínas também mostram uma variação na solubilidade que depende da concentração de sais em solução, sendo a maioria das proteínas muito pouco solúvel em agua pura, A concentração elevada de sais pode remover a água de hidratação das moléculas de proteínas reduzindo sua solubilidade, este efeito é chamado de “salting-out”. Ocorre também que em concentração reduzida, os sais aumenta a solubilidade de muitas proteínas, este efeito é chamado de “salting in”, e está relacionado a uma diminuição das interações entre grupos carregados de moléculas da mesma ou de diferentes proteínas5.

A detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações especificas com determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação.

O método fotocolorimétrico foi desenvolvido com a finalidade de dosar substâncias biológicas. Neste método são utilizadas reações que resultam em soluções coloridas. A intensidade da cor produzida é proporcional à concentração da substância que está sendo dosada. Em consequência desta proporcionalidade, é possível dosar substâncias em soluções de concentração desconhecida (AMOSTRA), ao comparar a intensidade da cor produzida por esta substância à intensidade da cor produzida pela mesma substância em outra solução onde a concentração é previamente determinada (PADRÃO)7.         

1. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1Reações de precipitação de proteínas

3.1.1 Efeito de ácidos fortes

Separou-se dois tubos de ensaio, ao tubo primeiro adicionou-se 40 gotas de HNO3 ao segundo tubo adicionou-se 40 gotas de HCl concentrado. Após, adicionou-se cuidadosamente 2 mL de solução de ovoalbumina. Observou-se a formação de precipitado branco.

3.1.2 Precipitação fracionada por soluções salinas concentradas

Em um tubo Falcon  adicionou-se 2 mL de solução de ovoalbumina e igual volume de solução saturada de (NH4)2SO4 , observou-se formação de precipitado branco. Em seguida, centrifugou-se a suspensão, ao precipitado adicionou-se 2 mL de água destilada, observou-se a solubilização do precipitado. Ao sobrenadante adicionou-se (NH4)2SO4 sólido até a saturação, observou-se a formação de precipitado.