DNA RECOMBINANTE

O DESENVOLVIMENTO DA TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE

Em última análise, a Tecnologia do DNA Recombinante consiste na técnica de reunião de DNAs derivados de fontes biologicamente diferentes. De acordo com BURNS & BOTTINO (1991), o processo geral baseia-se em três enfoques experimentais principais:

1. Produção de fragmentos de DNA de fontes diferentes que contenham as sequências gênicas de interesse;

2. Reunião desses segmentos em uma molécula de DNA capaz de se replicar, normalmente um plasmídeo bacteriano chamado vetor;

3. Transformação de células bacterianas com a molécula recombinante de modo que elas se repliquem e então se expressem.

O desenvolvimento desta nova tecnologia só foi possível pela descoberta, no final dos anos 1960, das enzimas ou endonucleases de restrição. Este tipo de enzima atua como uma espécie de "tesoura biológica" que, após reconhecer determinada sequência nucleotídica, faz corte bi filamentar na ligação açúcar-fosfato da molécula de DNA, produzindo fragmentos. Elas são produzidas naturalmente por bactérias como forma de defesa contra infecção viral, onde clivam em diversos fragmentos o material genético dos vírus, impedindo sua reprodução na célula bacteriana. Em contrapartida, a bactéria protege seu próprio DNA dessa degradação, modificando sua sequência de reconhecimento pela adição de grupos metila, fenômeno conhecido como metilação.

Interessante notar que cada bactéria tem suas próprias enzimas de restrição e cada enzima reconhece apenas um tipo de sequência, independente da fonte de DNA. As enzimas de restrição são de vários tipos, dependendo da sua estrutura, da sua atividade e de seus sítios de reconhecimento e clivagem. Para a Tecnologia do DNA Recombinante as mais importantes e mais usadas são as do Tipo II. Segundo Nascimento et al (2003), atualmente mais de 1000 enzimas de restrição diferentes já identificadas e isoladas de bactérias. A nomenclatura é baseada na abreviação do nome do microrganismo de onde a enzima foi isolada. A primeira letra refere-se ao gênero e as outras duas à espécie, seguido deum algarismo romano (ou outra letra) que indica a ordem da descoberta ou a linhagem da qual foi isolada. Por exemplo, a enzima de restrição EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de resistência RI.

Burns & Bottino (1991) afirmam que o sítio de reconhecimento das enzimas de restrição do Tipo II normalmente é uma sequência palindrômica, ou seja, apresenta a mesma leitura nos dois filamentos, mas em direções opostas. Assim se a sequência em um filamento é GAATTC lida no sentido 5'3', a sequência no sentido oposto é CTTAAG lida no sentido 3' 5', mas quando ambos os filamentos são lidos no sentido 5' 3' a sequência é a mesma. Portanto, segundo eles, o palíndromo apresenta-se da seguinte forma:

5' G A A T T C 3'

3' C T T A A G 5'

Estas enzimas reconhecem sequências específicas de 4 a 8 pares de bases (pb) na molécula de DNA e fazem dois cortes, um em cada fita. Os cortes podem ocorrer no eixo de simetria da sequência específica, gerando extremidades abruptas (não desencontrada),

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