Determinação De Proteínas

1 - Introdução:

Proteínas são polímeros orgânicos de alto peso molecular, cujos monômeros são aminoácidos ligados por ligações peptídicas. São macromoléculas complexas e podem ter até quatro tipos de estrutura. Dessa forma, apresentam diversas funções como estruturais, enzimáticas, hormonais, com função protetora, entre outras.

Os monômeros aminoácidos tem baixo peso molecular e são constituídos principalmente de carbono, hidrogênio, oxigênio e nitrogênio, sendo pelo menos um grupamento amina e outro carboxila. Formam entre si ligações peptídicas com a tradução do mRNA consequência da transcrição de parte da molécula de DNA, dando origem às proteínas. Tal processo ocorre, na maior parte das vezes, no citoplasma da célula. (GARRET, 2005)

Pode-se determinar quantitativamente proteínas através diversos métodos e com a construção de curvas padrões de proteína, entretanto os mais utilizados são as espectrofotométricas no ultravioleta e no visível e dentre esses os mais utilizados são o do Biureto, o de Lowry, do reagente de Bradford, do reagente de Smith e de absorção de proteínas no ultravioleta (ZAIA, 1998). Muitos fatores influenciam a escolha do método, entre eles a natureza dos constituintes da amostra, e possíveis interferentes e a concentração aproximada de proteína. Além disso, deve-se levar em conta em alguns casos a rapidez, praticidade e custo do método.

Apesar da sua complexidade estrutural, as proteínas podem ser hidrolisadas em seus constituintes aminoácidos por enzimas ou por meio de fervura com ácidos e álcalis sob certas condições. As proteínas puras e secas são razoavelmente estáveis, mas sob as condições em que são encontradas nos alimentos, elas tendem a se decompor à temperatura ambiente, auxiliadas pela ação bacteriana, e podem formar produtos tóxicos para o corpo; assim, é necessário conservar refrigerados, alimentos protéicos, como ovos, peixes, aves, carne e leite.

Tabela 1 - Teor de proteína em alguns alimentos usuais e sua classificação como fonte de aminoácidos essenciais para a nutrição humana. (VICENZI, p. 24, 2000)

PROTEÍNA - % ALIMENTO

30-44 Soja

20-25 Feijão

6-10 Arroz

8-11 Milho

8-15 Trigo

3,5 Leite de vaca (in natura)

12 Ovos de galinha

15-25 Carne de mamífero

18-20 Carne de galinha

20-35 Amendoim

20-24 Crustáceos e peixes

2 – Experimento:

I – DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO MÉTODO COLORIMÉTRICO DE LOWRY

O método de Lowry é atualmente o mais utilizado para a determinação espectrofotométrica de proteínas. Seu princípio baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e ácido fosfórico, (reagente de Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução ao reagir com proteínas, na presença do catalisador cobre II e produz composto com absorção máxima de 750 nm. (Lowry, 1951 por ZAIA, 1998). A vantagem desse método é sua alta sensibilidade, podendo detectar 0,02 a 0,2 mg/mL de proteína, podendo ser de 10 a 20 vezes mais sensível que a determinação por UV e 100 vezes mais que o método por Biureto.

I.1 – Materiais e Métodos

I.1.1 – Materiais:

• Solução de Albumina de ovo 0,2 mg/mL

• Amostra I

• Amostra II

• Reagentes do método de Lowry: reagente A, reagente B e reagente C (Reagente de Folin Ciocalteau)

• Tubos de ensaio

• Pipetas graduadas

• Espectrofotômetro

I.1.2 – Métodos:

Inicialmente prepara-se 2,0 mL de soluções diluídas a partir da solução de albumina de ovo 0,2 mL para a determinação da curva padrão de proteína pelo método de Lowry (L1: 2ml de solução de albumina; L2: 1,6ml de solução de albumina e 0,4 de água destilada; L3: 1,2ml de solução de albumina e 0,8ml de água destilada; L4: 0,8ml de solução de albumina e 1,2ml de água destilada; L5: 0,4ml de solução de albumina e 1,6ml de água destilada; L6: 0,2ml de solução de albumina e 1,8 de água destilada). Concomitantemente, preparam-se soluções diluídas da amostra I (1:6, 1:10 e 1:20), e da amostra II (1:4, 1:8 e 1:12) para a determinação de proteína pelo método e transfere alíquotas de 2,0 mL para tubos de ensaio (L7: 0,4ml da amostra I e 0,6ml de água destilada; L8: 0,2ml da amostra I e 1,8ml de água destilada; L9: 0,1ml da amostra I e 1,9ml da água destilada; L10: 0,5ml da amostra II e 1,5ml de água destilada; L11: 0,25ml da amostraII e 1,75ml de água destilada; L12: 0,2ml da amostra II e 1,8ml de água destilada).

Os procedimentos a seguir serão feitos para todas as soluções preparadas, soluções de albumina, da amostra I e da amostra II, e no tubo “branco” que terá 2 mL de água destilada ao invés de uma solução.

Adiciona-se 2,0 mL do Reagente A em cada um dos tubos de ensaio. Após homogeneização incuba-se os respectivos tubos em banho-maria a 50ºC por 10 minutos. Passado esse tempo os tubos devem ser resfriados em água de torneira.

Adiciona-se na sequência 0,2 mL de Reagente B em cada um dos tubos de ensaio e se agita bem. Os tubos devem ficar em repouso por 10 minutos. Então, adiciona-se 6,0 mL de reagente de Folin Ciocalteau (reagente C) e homogeneíza-se os tubos que devem ser incubados em banho-maria a 50ºC por 10 minutos e resfriados em água de torneira na sequência.

Calibra-se o espectrofotômetro com a solução “branco” e na sequência mede-se a absorbância a 660 nm das soluções de albumina diluídas para a construção da curva padrão de proteína pelo método de Lowry. Mede-se também a absorbância a 660 nm das soluções diluídas da amostra I e amostra II para a determinação da concentração de proteínas.

I.2 – Resultados e Discussão:

A tabela de diluição e de medida de absorbância para a solução de albumina