TRADUÇÃO ARTIGO

Detecção de Streptococcus do grupo B: Comparação de teste de PCR e cultura como um método de triagem para mulheres grávidas.

RESUMO

Streptococcus agalactiae ou Streptococcus do grupo B (GBS) é um dos mais importantes agentes causadores de serias infecções neonatais. Vários testes foram avaliadas para a triagem do GBS afim de validar um método rápido e eficiente. O objetivo deste estudo foi comparar a técnica de cultura (estabelecida como padrão-ouro) com o método molecular de reação em cadeia da polimerase (PCR) com iniciadores específicos do gene (ATR). Duzentos e sessenta e três amostras foram analisadas. Amostras vaginais foram coletadas, de acordo com as recomendações do Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC), de mulheres com mais de 35 semanas de gestação no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Dois métodos de extração diferentes foram testados em todas as amostras coletadas. A Técnica de PCR rendeu 71 (26,99%) resultados positivos. A sensibilidade e especificidade para a PCR foi de 100% e 86,88%, respectivamente. PCR mostraram um tempo de resposta mais curto do que o da cultura. A metodologia molecular provou ser útil para uma triagem de GBS, permitindo que um tratamento eficaz seja iniciado num tempo mais curto para evitar a infecção neonatal.

Palavras-chave: Streptococcus agalactiae, reação em cadeia da polimerase, cultura, gravidez.

INTRODUÇÃO

Streptococcus agalactiae , ou Lancefield grupo B Streptococcus (GBS), é um dos mais importantes agentes causadores de infecções graves e sepse neonatal. 40% das mulheres grávidas apresentam colonização retal e / ou vaginal de GBS. 4 A incidência de infecção neonatal por GBS é de 0,5 por 100 nascidos vivos. A transmissão vertical da mãe para o recém-nascido por qualquer via é de até 75% dos casos de colonização de GBS neonatal, e 1% a 2% destas crianças irão desenvolver infecção precoce de GBS. 5,6

Desde 2002, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) recomendam a triagem GBS para gestantes por método baseado em cultura. Este método é preferível, resultando numa prevenção mais eficaz baseada no risco da quimioprofilaxia.( recomendação anterior da CDC). 7-9 O método padrão para o diagnóstico de colonização de GBS consiste de cultura combinada de esfregaço vaginal e anal num meio liquido seletivo que inibe o crescimento de microrganismos não-GBS. No entanto, este método requer, no mínimo 48 horas para a identificação total do GBS. Além disso, os resultados negativos da cultura são observados em algumas mulheres cujos filhos desenvolveram posteriormente uma infecção por GBS. 10

Um teste de triagem ideal para colônia de GBS é que pode identificar com precisão as mulheres grávidas que carregam a bactéria (até mesmo de baixa contagem de bactérias carregadas) e apresentar um tempo de resposta curto. Muitas técnicas têm sido testadas, a fim de validar um método rápido e eficiente de triagem GBS para substituir a cultura. 11-13 Hoje em dia, ensaios baseados em biologia molecular, tais como testes de PCR (polymerase chain reaction), tornaram-se o foco da investigação de detecção de colonização de GBS em mulheres grávidas. 14,15 Nesses testes, as amostras de preparação e ampliação alvos são decisivas para ensaio de desempenho. Uma boa meta para amplificação do GBS é o atr gene porque é bem estudado nesta espécie. Além disso, o ATR é um gene essencial, o que significa que tem que ser expresso / presente em todas as células da espécie. O gene codifica uma proteína de aminoácido transportador gs0538 que é extremamente específico para espécies do S. agalactiae . Por ser um gene housekeeping(de controle,manutenção), a probabilidade de mutações em atr é relativamente muito baixa. 16,17

O objetivo do estudo foi comparar o método PCR deste gene atr com o padrão de ouro de (método de cultura de base) para avaliar o desempenho de PCR como de triagem da colonização de GBS em mulheres grávidas. Além disso, foram testados dois métodos de extração diferentes para amplificar atr gene: um kit comercial e protocolo de lise térmica, buscando testes moleculares mais rentáveis.

MATERIAIS E MÉTODOS

Amostras

Combinados de amostras retal / vaginal foram coletadas para a realização deste estudo de acordo com as recomendações do CDC. Amostras coletadas foram enviadas para o laboratório de microbiologia e testes moleculares para Identificação do Streptococcus do grupo B. Foram analisadas 263 amostras de mulheres com 35 ou mais semanas de gestação, no parto ou não, que frequentavam quarto obstétricos de emergência no Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA) desde setembro de 2007 a setembro de 2008.

Testes de microbiologia

Os esfregaços foram inoculadas em meio seletivo de Todd Hewitt (Himedia Laboratories, índia) com gentamicina (8 ug / ml) e ácido nalidíxico (15 mg / mL). O meio seletivo foi incubado a 36 º C em 5% de CO² durante 18 horas, e depois subcultivadas em placas de agar de sangue (BioMérieux, Marcy l'Etoile, França), que foram incubadas a 36 º C em 5% de CO 2 durante 24 horas. Após a incubação, as placas foram inspecionadas por colônias β - hemolíticas. Quando não foram observados colônias β-hemoliticas após 24 horas, as placas foram reincubados por 24h e inspecionadas novamente. As colônias β- hemolíticas, cuja morfologia foi consistente com o Streptococcus do grupo B foram subcultivadas em liquido e submetido ao teste de CAMP (Christie, Atkins, Munch, Petersen). As colônias positivas para o teste de CAMP foram presumivelmente considerado GBS.

Reação em cadeia de polimerase (PCR)

A preparação das amostras e a extração do DNA

Os esfregaços foram incubadas durante 15 a 18 horas em meio seletivo de Todd Hewitt. Após centrifugação do liquido , o precipitado foi lavado com uma solução de PBS 1X e ressuspenso em tampão TE (10 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM, pH 7,5). Esta solução foi submetida a dois diferentes protocolos de extração de DNA: lise térmica e lise térmico seguido de extração sílica de DNA pelo kit comercial.

A lise térmica foi realizada utilizando uma solução de TE durante 10 minutos a 100° C para quebrar a parede celular bacteriana. 18 O segundo protocolo de extração de DNA foi realizada utilizando o kit comercial QIAmp (Qiagen, Valencia, EUA), de acordo com as instruções dos fabricantes. Este passo adicional na extração de DNA foi realizada para assegurar a eliminação