CENTRO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA COLORAÇÃO DE GRAM

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS[pic 1][pic 2]

CAMPUS LAGOA DO SINO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA NATUREZA

COLORAÇÃO DE GRAM

Alunos: Guilherme Azanha Carneiro 758831

Helen Cristina Franco 727298

Professora: Roberta Barros Lovaglio

BURI- SP

JUNHO/ 2019

1. INTRODUÇÃO

A coloração de Gram é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram (1884), fundamentada no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com o reagente cristal violeta, lugol, álcool-acetona e fucsina básica. Esta técnica permite distinguir células bacterianas quanto à composição das suas paredes celulares, facilitando a observação morfológica das próprias células, através da coloração diferencial, dado que permite dividir as bactérias em duas classes: Gram negativas (Gram -) e Gram positivas (Gram +). (TRABULSI, 2008)

Esta diferenciação se baseia na estrutura e composição, principalmente no teor lipídico da parede celular de bactérias, pois, Gram negativas tem um teor em lípidos elevado na sua membrana externa, além de uma camada fina de peptidoglicano que circunda a membrana plasmática. Já a parede celular das bactérias Gram positivas é constituída principalmente por uma camada grossa de peptidoglicano e o seu teor em lípidos é nulo ou muito baixo (em poucas espécies bacterianas) (TORTORA, 2005). Na figura 1 pode se observar as diferenças dos formados entre eles, sendo que o negativo na forma de esfera e o do positivo no de cilindro.

Figura 1: Distinção do Gram + e do Gram -

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Fonte: FILHO, 2004

 Em termos físico-químicos, o processo baseia-se na reação de um corante alcalino com os ácidos da célula. Por adição de lugol (solução de iodo) forma-se um complexo que, quando se aplica o álcool, desaparece ou é retido, consoante a diferente sensibilidade das paredes celulares. Torna-se assim possível distinguir esta diferenciação, consoante a cor final que as células tomam. Esta coloração é um dos critérios fundamentais usados em taxonomia bacteriana, pois esta diferença de comportamento é atribuída a diferenças na composição da parede celular. (TRABULSI, 2008)

A reação de Gram de uma bactéria pode fornecer informações valiosas para o tratamento da doença. As bactérias Gram-positivas tendem a ser mortas facilmente por penicilinas e cefalosporinas. As bactérias Gram-negativas geralmente são mais resistentes, pois os antibióticos não podem penetrar na camada de lipopolissacarídeo. Parte da resistência a estes antibióticos entre ambas a bactérias Gram-positivas e Gram-negativas é devida a inativação bacteriana dos antibióticos. (FILHO,2004).

As bactérias utilizadas no presente estudos foram a Bacillus subtilis e Escherichia coli. A Bacillus subtilis apresenta como excelente agente de biocontrole, encontrada como rizobactérias promotoras de crescimento em plantas, que tem como habitat natural o solo (FILHO; FERRO; PINHO, 2010). A Escherichia coli é pertencente à família Enterobacteriaceae, que tem como habitat o trato intestinal humano e animal. Existem seis categorias patogênicas que causam infecção intestinal, denominadas de E. coli diarreiogênicas, diferenciadas pela presença de fatores de virulência como adesinas fimbriais e afimbriais, toxinas e invasinas (SOUZA et al., 2016).

1. OBJETIVO

Separar as bactérias em dois grandes grupos: Gram positivo (Gram +) e Gram negativo (Gram -).

1. MATERIAS E MÉTODOS

Primeiramente, iniciou o experimento esterilizando a bancada do local da área de estudo com o álcool (70%) e papel. Em seguida também esterilizou a alça de inoculação sobre a chama do bico de bulsen, segurando a alça com a mesma semelhança de uma caneta e esperou com que ficasse incandescente.

Não trocando de mão, pegou e abriu o tubo de ensaio com a cultura do microrganismo em meio líquido, passou a borda do tubo na chama do bico de bulsen a fim de esterilizar- ló, retirou com a alça de inoculação um pouco de células, passou novamente a borda do tubo sob a chama para novamente esterilizar e fechou- se o tubo, em seguida colocou o microrganismo líquido em uma lâmina segurando com auxílio de um pregador. Para que possa fixar a lâmina, flambou- se sobre a chama do bico de bulsen com o cuidado para que não queimasse.  

Próximo passo foi colorir os microrganismos já fixados na lâmina. Colocou duas gotas da solução de Cristal Violeta sob o esfregaço por 1 minuto, ao passar do tempo escorreu a solução, lavou em fio d’água e cobriu o esfregaço com Lugol por 1 minuto. Em seguida, discorreu rapidamente com Álcool Etílico (70%) por 20 minutos, após, lavou- se o esfregaço em fio d’água e cobriu com duas gotas de Fucsina diluída por 30 segundos, depois lavou e flambou novamente para secar.

No último passo, observou o esfregaço no microscópico com o intuído de ver a separação de Gan (+) e Gran (-), para enxergarmos utilizou duas gotas de óleo de imersão para que o índice de refração seja igual para a lâmina de vidro e de óleo.

Repetiu- se todo o experimento para realizar com a cultura do microrganismo em meio sólido.

1. RESULTADOS

Quando coradas com derivados de rosanilina, no caso o cristal-violeta, e tratadas pelo Lugol, formam uma coloração escura entre iodo e o corante, retido em bactérias Gram positiva e não pode ser removível pelo tratamento com álcool, ao passo que na Gram negativa, este composto é facilmente descorado pelo álcool. Em seguida, com uma segunda coloração de fucsina, a Gram negativa apresenta cor vermelha, devido ao corante de fundo, e a Gram positiva na cor roxa, pois conserva o corante inicial (NOGUEIRA; MIGUEL, 2009).