O Núcleo Interfásico

Compartimentação subnuclear do Loci de imunoglobulina durante o desenvolvimento de linfócitos - Kosak 2002

INTRODUÇÃO

• Heterocromatina constitutiva e a periferia nuclear são as duas principais classes de subcompartimentos nucleares transcricionalmente repressivos.
• Estudos em Drosophila e mamíferos: sugere que a organização de genes em heterocromatina pode ser um mecanismo de repressão transcricional regulada.
• Saccharomyces cerevisiae: papel da periferia nuclear como compartimento repressivo (aglomerado de telômeros na periferia, levando ao aparecimento de proteínas Sir que são envolvidas no silenciamento).
• Análises em humanos, mostraram que cromossomos “pobres” em genes estavam estão preferencialmente localizados na periferia nuclear, enquanto cromossomos que possuem mais genes estavam mais voltados para o centro.
• GAP: a atividade gênica em eucariotos é regulada pela localização perinuclear?
• Durante o desenvolvimento do linfócito B, os loci da cadeia pesada (IgH) e leve (IgL) da imunoglobulina sofrem transcrição e rearranjo regulados. Já em linfócito T, os loci da Ig não são substancialmente recombinados.
• A “hipótese da acessibilidade” sugere que a recombinação V(D)J programada pelo desenvolvimento é controlada por alterações localizadas na estrutura da cromatina.

OBJETIVO: Dada a evidência de que a atividade do gene eucariótico pode ser regulada por compartimentalização subnuclear, eles investigaram se tal processo pode desempenhar um papel no controle da transcrição e rearranjo de loci de Ig durante o desenvolvimento de linfócitos B.

• O locus IgH é recombinado para produzir um gene funcional de três grupos de segmentos gênicos, V, D e J, que são sequencialmente ativados para transcrição da linhagem germinativa antes de seu rearranjo. Durante o estágio de desenvolvimento pró-B, a matriz VH é transcrita e está pronta para sofrer recombinação V-para-DJ. 

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O que fizeram: Análise de hibridização in situ de fluorescência bidimensional (2D) (FISH) para examinar a disposição nuclear de loci IgH em linhagens celulares murinas pró-B (38B9) e T (EL-4).

• Resultado: (Fig. 1, A e G) Cerca de 50% dos sinais de cada uma das três sondas VH, ou seja, da região variável da cadeia pesada (VhJ558, Vh15 e Vh7183) foram preferencialmente localizados na periferia nuclear em células EL-4 (células T).
• (Fig. 1, B e G) E em células 38B9 (pró-B) os loci IgH foram dispostos centralmente e muitas vezes com alelos próximos.  
• (Fig. 2, A e B) Para verificar nossos resultados 2D, realizamos um FISH tridimensional (3D). A análise confocal mostrou 95% dos sinais VhJ558 na periferia em núcleos EL-4; no entanto, apenas 5% eram perinucleares em células 38B9.
• Confirmando que o locus IgH é enriquecido na periferia nuclear em células T EL-4, enquanto é excluído deste domínio em células 38B9 pro-B.

O que fizeram: Para confirmar se a compartimentalização subnuclear do locus IgH é modulado durante ao desenvolvimento, eles analisaram progenitores hematopoiéticos (Lin– ), células pró-B geradas a partir desses progenitores e células pró-T (timócitos DN).

• (Fig. 1, D, E e G) Cerca de 50% dos sinais VH em progenitores multipotenciais e 30% em células pró-T foram localizados na periferia nuclear. O grau reduzido de localização perinuclear em células pró-T está correlacionado com sua capacidade limitada de sofrer rearranjo DH-JH.
• (Fig. 1, F e G) Em contraste, menos de 5% dos sinais VH eram periféricos em núcleos pró-B.
• (Fig. 1G) Uma sonda CH que se encontra na extremidade 3’ do locus de IgH mostrou consistentemente uma porcentagem menor de sinais periféricos em progenitores multipotenciais e células pró-T em comparação com sondas mais a 5’ do DNA, o que sugere que o segumento 3-MB da IgH pode estar associada a periferia nuclear através dos segmentos gênicos V distais, o que pode não impedi a acessibilidade da região D-J proximal aos fatores de transcrição e recombinação.
• (Fig. 1G) sonda de controle (YAC M90E5) localizada a cerca de 8 cM do locus IgH não variou em seu padrão de distribuição nos diferentes tipos de células.
• (Fig. 1, C e G) A compartimentalização de loci IgH inativos na periferia nuclear parece representar o estado padrão. Consistente com esta possibilidade, loci IgH são encontrados para ser perinucleares em células-tronco embrionárias (ES).

O que fizeram: Foi demonstrado que um subconjunto de aglomerados de heterocromatina centromérica localiza-se na periferia nuclear, então pra testar se a localização periférica do locus IgH pode ser devido a sua associação com o domínio de heterocromatina, eles realizaram FISH 3D com a sonda VhJ558 e uma sonda para gama-satélite de DNA, o principal elemento repetitivo do camundongo usando células T EL-4 e pró-B 38B9 cells.

• (Fig. 2C) Os loci de IgH (97%) nos núcleos de EL-4 não foram associadas à heterocromatina centromérica.
• (Fig. 2, D e E) Como esperado, a maioria dos loci IgH transcricionalmente ativos (89%) em núcleos 38B9 também não foram associados com centroméricos heterocromatina.

Conclusão: O loci IgH não são posicionados na periferia por uma interação com a heterocromatina centromérica.

O que fizeram: Foram analisar a possibilidade dos loci IgH periféricos estarem associados à lâmina nuclear, por meio de FISH 3D com sonda VhJ558 e anticorpos para os terminais NH2- e COOH da lâmina B, um componente da lâmina nuclear.

• (Fig. 2F) A análise mostrou uma justaposição predominante de sinais Vh com a lâmina nuclear em células EL-4, o que pode sugerir que o locus IgH pode ser sequestrado para a periferia nuclear através de uma interação com a lâmina nuclear através de uma interação direta com a lâmina nuclear ou suas proteínas associadas.
• (Fig.2G) Por outro lado, em núcleos 38B9, 95% dos sinais VH foram posicionados longe da lâmina nuclear.

O que fizeram: realizaram FISH 2D com sondas para os loci da cadeia leve (k e lambda) para investigar se a localização periférica em células não-B é uma propriedade geral dos genes Ig.

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