Bioprocessos e Biotecnologia voltados à Diagnósticos

Bioprocessos e Biotecnologia voltados à Diagnósticos

Guilherme Luis Pereira ([e-mail])

AULA 07  – Diagnóstico de parentesco e outras aplicações da identificação individual pelo DNA

IDENTIFICAÇÃO INDIVIDUAL PELO DNA: criar padrões de bandas que são exclusivos ao indivíduo, criando um fingerprint deste;

- Base genética: identificação de polimorfismos como alterações pontuais, inserções ou deleções e regiões repetitivas (estas guardam muita informação em um mesmo locus), por microssatélites (STRs); Estas são estruturas que se repetem no material genético em tandem, geralmente em mamíferos ocorre CA eTG; Altamente polimórfico (vide slide das sequências) e co-dominante; O polimorfismo de STRs é resultado da amplificação por PCR de produtos de diferentes tamanhos (PCR Multiplex) em função do número de elementos repetitivos.

- Técnica por eletroforese capilar: marcadores são selecionados para evitar sobreposição de bandas (primers com fluoróforos específicos que serão excitados por um laser após passar pelo capilar, que utilizam padrões de tamanho para diferenciar os tamanhos das moléculas por tempo de migração, realizam uma regressão do gráfico para obter o tamanho exato do fragmento de interesse – semelhante a um sequenciamento Sanger);

        - Ladder: utilizado para saber quantas repetições estão presentes, inserido no padrão.

TESTE DE PATERNIDADE E MATERNIDADE: pode ser realizado em trio ou duo, sendo o primeiro uma análise melhor, pois confirma-se de onde veio o outro alelo (exemplo slide) – ou seja, em duo não se pode ter certeza da origem do alelo;

- Poder informativo de STRs:

- Utilização de SNPs: os SNPs podem ser marcados para criar uma padronização dos STRs, ou seja, você irá substituir a utilização dos STRs por SNPs, que são mais baratos para análise e pode ser feito vários de uma vez.

RASTREABILIDADE DE CARNE: além da rotulagem dos produtos, a rastreabilidade pode ser feita por identificação individual pelo DNA, denominado de tracing (quando não há o código de barras);

SEXAGEM DE EMBRIÕES: marcadores STS (Sequence Tagged Sites) para a região Y e outra região autossômica (controle); Realização de um padrão de bandas aleatório (PCR Multiplex) → observar determinada banda que aparece em macho ou fêmea → isolar esta banda → desenvolver o primer que servirá de marcador para o sexo macho ou fêmea;

SEXAGEM DE CARNE: quando o produto não é individualmente identificado; para problemas de mistura de carnes de origem de vaca; segue o mesmo princípio para os embriões.

AULA 08 – Regulação da expressão gênica e Análise de expressão gênica

- Analisar o porquê das diferenças entre células de um mesmo indivíduo através da regulação da expressão dos genes.

- Tipos de genes: podem ser constitutivos (aqueles que produzem estrutura, proteínas de metabolismo, etc.) ou regulados.

REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA: ocorre por sinais moleculares (fora ou dentro) levam a ligação de proteínas reguladoras... (slide).

PROCARIOTOS:

- Óperon: estrutura gênica constituído por um promotor, operador (sítio regulatório) e genes estruturais em seguida um do outro. Ou seja, são diversos genes...

- Regulação positiva: a presença da proteína reguladora faz com que a DNA pol transcreva.

- Regulação negativa: a presença impede.

- Óperon Lac: codifica 3 proteínas a partir de um gene (RNAm poli).

1) Controle negativo: Na presença da proteína (produzida pelo gene i) ocorre a repressão da transcrição do óperon lac. Quando o indutor (efetor - lactose) liga-se à esta proteína (modificação alostérica), a proteína desliga-se do material genético e permite a transcrição dos três genes existentes.

2) Controle positivo: alto nível de glicose e consequente baixo nível de cAMP (alto de ATP) e o baixo nível de glicose apresenta alto nível de cAMP (baixo de ATP). Sendo assim, com baixa glicose (cAMP presente em maior quantidade – menor energia na célula) o cAMP atuará como efetor, ligando-se na proteína reguladora CAP, ativando a expressão.

DIFERENÇAS ENTRE EUCARIOTO E PROCARIOTO: Para eucaritos, genomas maiores; regulação mais complexas (requer mais proteínas reguladoras e mais tipos de interações com as regiões – mais sequencias de DNA); regulação pela cromatina (agente de regulação extra); não há óperon; sequências regulatórias distantes do promotor; diferentes perfis de expressão de acordo com a célula/tecido.

EUCARIOTO:

- Regiões promotoras: sao divididas em duas partes, TATA box (sitio promotor) e região rica em GC (ligação dos elementos promotores – em alguns casos podem regular).

- Regiões regulatórias: equivale ao operador da bactéria, porém com maior complexidade; a proteína, como por exemplo a Gal4, apresenta duas regiões, ligação ao DNA e a de ativação (a qual dirá se é para ligar ou não); sendo assim, com o estimulo dado e a proteína ligada, o sítio de ativação se ligará a algumas proteínas que recrutaram proteínas para transcrição (um exemplo está no mediador da DNA pol, o qual guia a DNA pol para o local correto de transcrição); geralmente as proteínas que se ligam a região ativadora são por interações estruturais como resíduos ácidos (caso da Gal4) e hidrofóbicos.