DNA recombinante

DNA RECOMBINANTE

PALESTRANTE: BRUNA

        A técnica do DNA recombinante consiste em um conjunto de práticas que permitem isolar e transferir sequências de DNA para outros organismos, possibilitando novas características. Organismos transgênicos, terapia gênica e produção de proteínas terapêuticas são exemplos de aplicabilidade.

         Técnica esta que somente é permitida devido a dupla cadeia complementar da fita antiparalela do DNA, possuindo capacidade de replicação, de ser estável, naturação e desnaturação.

        Alguns objetivos possíveis:

• Isolar um gene particular;
• Produção de proteínas;
• Expressar novas características.

COMO PRODUZIR?

1. Isolar o gene;
2. PCR, onde a 95°C ocorre à desnaturação do DNA, a 60°C o anelamento dos primers e 75°C a polimerização;
3.  Inserir o mesmo em um vetor;
4. Inserir o vetor em célula e aplicar um choque térmico (CaCl2) e eletroporação;
5. Selecionar os hospedeiros;
6. Clonar o DNA recombinante;
7. Expressar o gene e purificar a proteína.

Quanto ao isolamento, utilizam-se enzimas de restrições que nada mais são do que endonucleases capazes de romper assimetricamente as ligações fosfodiesters, cortando assim, a parte do genoma que contem o gene de interesse. Obtêm-se o cDNA a partir do RNAm e a sintetização química do DNA a partir da biblioteca genômica, DNA este, que não possui introns por exemplo.

Quanto ao vetor, precisa-se de uma molécula capaz de se ligar ao gene de interesse (DNA exógeno) e o transportar para uma célula hospedeira. O ideal seria uma molécula pequena, com presença de sítios de restrição e intensa replicação dentro da hospedeira. Os mais utilizados são os plasmídeos bacterianos. Todo vetor precisa de um promotor.

 Para a utilização de bactérias primeiramente há a neutralização de sua carga negativa pelo já citado CaCl2 e para a seleção das mesmas é feito testes em antibióticos, onde coloração específicas são expressas, caso não haja, as mesmas morrem pela ação biocida do mesmo.

EXEMPLO ESQUEMÁTICO:

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