A Cultura de Bactérias Utilizando a Coloração de Gram

1. INTRODUÇÃO

As bactérias tem um papel importante no equilíbrio ecológico, são elas responsáveis por absorver o nitrogênio diretamente do ar atmosférico o transformando em sais nitrogenados que nutrem as plantas e que são passadas através da cadeia alimentar para outros animais, elas se fazem presentes em todo o lugar e existem aquelas que essencialmente fazem parte da microbiota humana.

As bactérias são seres unicelulares e podem ser encontradas tanto isoladamente quanto em colônias, não possuem núcleo organizado e seu material se encontra disperso no citoplasma, além disso, não possuem organelas membranosas. O tamanho, a forma e o arranjo definem sua morfologia, que se apresenta em três tipos gerais: cocos, bacilos e espiralados e se subdividem respectivamente em forma de cocos: diplococos – cocos agrupados aos pares; tétrades – agrupamentos de quatro cocos; sarcina – agrupamentos de oito cocos em forma cúbica; estreptococos – cocos agrupados em cadeias; estafilococos – cocos agrupados em grupos irregulares, lembrando cachos de uva; forma de bastonetes: tem formato cilíndrico, há diferenças no tamanho e no gênero de cada uma delas; formas espiraladas dividem-se em dois grupos: espirilos e espiroquetas. Elas se diferem também quanto à reprodução que pode ser sexuada, assexuada ou por bipartição.

 De acordo com VIEIRA e FERNANDES “As bactérias podem ser divididas em dois grandes grupos, com base na capacidade de suas paredes celulares fixarem o corante violeta cristal: as Gram positivas (coloração roxa) e as Gram-negativas (coloração vermelha)”. As bactérias Gram positiva são constituídas por uma parede celular simples formada por uma membrana plasmática e uma camada espessa de peptidioglicano enquanto as bactérias gram negativas são constituídas por uma parede celular mais complexa que contém uma membrana plasmática, uma camada de peptidioglicano e uma membrana externa semelhante à membrana plasmática. Como Corrobora VALERA “A técnica tem importância clínica uma vez que muitas das bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clínico monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis”.

1. OBJETIVOS

• Realizar a cultura de bactérias utilizando a técnica de coloração de Gram;
• Identificar o tamanho, a forma e o arranjo das bactérias encontradas em dois objetos mais usados, escolhidos pela equipe;
• Classificá-las em Gram positiva ou Gram-negativa.

1. METODOLOGIA

Materiais Utilizados:

• Luva;
• Placa de Petri;
• PCA e ANB;
• Cotonete;
• Estufa;
• Alça de Platina;
• Lâmina para microscópio;
• Bico de busen;
• Microscópio;
• Violeta-de-metila
• Lugol fraco
• Solução descorante/álcool
• Fucsina
• Óleo de imersão
• Objetos para a coleta: Brinco e maçaneta
• Conta gotas

1° Etapa-Coleta: Primeiramente preparou-se o meio de cultura na qual foi despejado o líquido ANB dentro da placa de petri. Utilizando um cotonete foi feita a coleta das bactérias presentes na maçaneta e logo em seguida foram depositadas na placa de petri realizando movimentos circulares e em zig zag. Após esse processo as placas de petri foram fechadas com plástico filme e levadas à estufa. As placas ficaram dentro da incubadora durante sete dias para que as bactérias pudessem se proliferar.

Em outra parte do procedimento preparou-se outro meio de cultura na qual foi despejado o líquido PCA dentro da placa de petri. Realizando os mesmos procedimentos anteriormente citados foi utilizado um cotonete em que foi feita a coleta das bactérias presentes no brinco e logo em seguida foram depositadas em outra placa de petri realizando movimentos circulares e em zig zag. Após esse processo as placas de petri foram fechadas com plástico filme e levadas à estufa. As placas ficaram durante sete dias para que as bactérias pudessem se proliferar.

2ª Etapa-Análise microscópica: No 8° dia as placas foram retiradas da incubadora para ser realizada outra etapa do processo, a coloração de Gram. Retiraram-se os plásticos e com o auxílio da alça de platina foi realizado o esfregaço. A amostra foi depositada nas lâminas e logo foi realizada a coloração de Gram.

Com o auxílio de um conta gotas foi despejado na lâmina já com a bactéria a violeta-de-metila e deixou-se agir durante 60 segundos, logo a lâmina foi lavada com água destilada, repetindo o mesmo procedimento anteriormente, despejou-se por toda a lâmina a solução descorante e deixou-se agir por 30 segundos, o procedimento foi finalizado com a aplicação da fucsina agindo por mais 30 segundos. A secagem da lâmina foi feita utilizando o bico de busen, o passo seguinte foi levá-la ao microscópio para a realização da análise, despejou-se uma gota de óleo de imersão para ser observado com melhoria no microscópio.

1. RESULTADOS

Os procedimentos anteriormente citados foram realizados em duas aulas de laboratório supervisionado e orientados pela professora Érika Oliveira, na primeira aula foi realizada a coleta das bactérias em objetos específicos que foram escolhidos pelos integrantes da equipe que foram o brinco e a maçaneta, já a segunda foi realizada os devidos procedimentos para o resultado do mesmo, utilizou-se um microscópio óptico em que foi feita a visualização das laminas coradas. Primeiramente foram inseridas as lâminas no microscópio com lente objetivo 4x, na qual foi possível observar a coloração de Gram, mas não foi possível observar a forma nem os arranjos bacterianos.

Encontraram-se apenas os resultados em apenas um único objeto, no brinco, em contrapartida com a maçaneta ocorreu um erro no momento da realização dos procedimentos e não foi possível identificar nada na lâmina, devido o excesso da coloração impedindo a secagem. Logo, após foi passado a lâmina do brinco para 10x, sendo possível visualizar o material, mas não as formas e os arranjos, após, passado para objetiva 40x ainda não sendo possível identificar as formas e nem os arranjos. Na objetiva de 100x foi necessário aplicar o óleo de imersão para melhor resolução para que pudesse identificar a forma e o arranjo bacteriano. Após a focalização na lente de imersão, conseguiu-se identificar na lâmina os estafilococos, os mesmo são em formato de cachos de uva sendo eles Gram positivos.