Conceitos Básicos em Imunologia

Nome: Mariléia Ferrari

Módulo de Bioquímica.

Curso de Enfermagem\UNISC.

Desnaturação e determinação quantitativa de proteínas

As proteínas são polímeros formados pela condensação de unidades repetitivas de aminoácidos através de uma ligação peptídica, que se dá entre o carbono da carboxila (COOH) de um aminoácido e o nitrogênio do grupo amina de outro aminoácido.

A unidade estrutural básica de uma proteína é o aminoácido, como pode demonstrar facilmente em uma hidrolise química ou enzimática de uma proteína purificada.

A cadeia peptídica resultante dessa condensação caracteriza-se por possui uma extremidade que contém o grupo carboxila e outra extremidade que contém um grupo amino. A linha formada pelos átomos de carbono e nitrogênio que formam a ligação peptídica é chamada de esqueleto peptídico.

As proteínas são classificadas em quatro níveis estruturais:

Estrutura primária é definida como a sequência linear dos resíduos dos aminoácidos que constituem sua cadeia polipeptídica.

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Estrutura Secundária é uma estrutura que um polipeptídio ou uma proteína pode possuir em consequência de interações das ligações de hidrogênio entre aminoácidos distantes. Existem dois tipos de estrutura secundária: a alfa-hélice e Beta-pregueada.

[pic 2]

Estrutura terciária é quando uma cadeia polipeptídica forma uma estrutura complexa, ela enrola-se ou dobra-se e se torna uma estrutura mais ou menos rígida. Exemplo estrutura terciária de uma mioglobina:

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Estrutura quaternária é uma estrutura resultante de interações entre unidades polipeptídicas isoladas de uma proteína contendo mais de uma subunidade.  A união desta estrutura quaternária é mantida por meio de forças iônicas e pontes de hidrogênio. Estas podem ser diméricas (formada por duas unidades), triméricas (formadas por três subunidades) e multiméricas (várias subunidades).

Um exemplo de molécula que apresenta estrutura quaternária é a hemoglobina.

[pic 4]

A Desnaturação da proteína

A maioria das proteínas apresenta uma conformação espacial globular e são soluveis em água. Esta solubilidade pode ser alterada com uso de algumas técniccas que desnaturam a biomolécula. Esta desnaturação implica a perda da conformação nativa da proteína, com consequente perda da solubilidade (ocorre precipitação da proteína) e consequentemente perda da sua função biológica.

Lembrando sempre que o processo de desnaturação da proteína não causa quebra da ligação peptídica.

A proteína desnaturada, apresenta a seguintes alterações:

• Físicas: aumento da viscosidade, não podem ser cristalizadas ou auto-organizadas.
• Químicas: maior reatividade devido à exposição a grupos químicos que estavam encobertos por estruturas. Consequente precipitação.
• Biológicas: perda de suas propriedades enzimáticas, antigênicas e hormonais, facilmente ingeridas por enzimas hidrolíticas.

A determinação quantitativa da concentração de proteínas

Ao se quantificar uma determinada proteína em material biológico ou não vários métodos podem ser utilizados: absorção no ultravioleta, método de folin-Lowry, método de Kejedahl, método do biureto, entre outros.

O método de biureto fa uso da propriedade de íons cobre em meio alcalino de formar ligações com o nitrogênio das ligações peptídicas. Desta reação resulta uma coloração purpura intensa. Esse fato pode ser explorado para se determinar por colorimetria a quantidade de proteína de uma solução. A cor desenvolvida numa reação de íons cobre em meio alcalino com estas proteínas deve-se exclusivamente às ligações peptídicas e a sua intensidade é proporcional à quantidade de tais ligações. A intensidade da cor formada pode ser medida espectrofotometricamente a 540 nm.

Os objetivos desta prática foram:

• Reconhecer ácidos fortes como agentes precipitantes das proteínas;
• Reconhecer o calor como agente desnaturante das proteínas;
• Desenvolver habilidade na utilização de técnicas espectrofotométricas;
• Dosar proteínas por espectrofotometria na região do visível.

Experimento 1: Desnaturação de proteínas por ácidos fortes

Agitamos o frasco contendo a solução de proteínas e transferimos está solução 1 ml para o tubo de ensaio. Após agitamos o ácido tricloroacético e colocamos 0,5 desta para o tubo contendo a solução de proteínas. Adicionamos 5 ml de água destilada. Após aguardamos o resultado.

Neste experimento observamos que a proteína desnaturou e precipitou, mudando sua coloração para branco no fundo do tubo de ensaio.

Experimento 2:Desnaturação de proteínas pelo calor