A tireoide é uma glândula que se localiza na base do pescoç

Introdução

A tireoide é uma glândula que se localiza na base do pescoço. A tireoide capta o iodo consumido nos alimentos e o junta a um aminoácido chamado tirosina para criar dois hormônios, conhecidos como triiodotironina (T3) e tiroxina (T4).

A Tiroxina (T4), principal hormônio da tireóide, circula na corrente sangüínea transportado por proteínas. O veículo transportador é o TBG (globulina ligadora de tiroxina ). Apenas a porção livre da Tiroxina (não transportada por TBG) é responsável pela ação biológica. O T4 é, na verdade, um pró-hormônio, ou seja, um precursor do T3. 80% do T4 lançado na corrente sanguínea, ao chegar em órgãos ou tecidos, como fígado, rins, baço, músculos ou gordura é transformado em T3 para utilização das células. Portanto, o T3 é efetivamente o hormônio tireoidiano que age no nosso organismo, tendo sua origem predominantemente no T4 circulante. Apenas uma pequena parcela do T3 atuante é diretamente produzida pela tireoide.

A dosagem do T4 livre sanguíneo é o exame que nos dá realmente a noção de quanto hormônio tireoidiano potencialmente útil há na circulação. Se houver muito T4 livre circulante, haverá muita produção de T3 nos órgãos, levando ao hipertireoidismo. Se houver pouco T4 livre circulante, haverá falta de T3 para os tecidos, provocando o hipotireoidismo.

O método de enzimaimunoensaio usado para determinar a concentração de T4 livre em soro sanguíneo se baseia no ELISA competitivo. A amostra (que contém o t4 livre) e o conjugado (reagente do kit que é composto pelo T4 + enzima) competem entre si para ligação no anticorpo anti T4 que está imobilizado na microcavidade. Então, adiciona-se dois substratos os quais reagem entre si resultado em uma reação que gera cor e essa reação é catalisada pela enzima presente no conjugado. Desse modo, uma maior intensidade da cor é obtida quando há menor concentração de t4 livre na amostra, ou seja, a absorbância é inversamente proporcional à concentração de T4 livre.  O uso de Padrões Referência com várias concentrações de T4 livre permite a construção de uma curva de calibração. Da comparação da curva, a concentração de T4 livre de uma amostra desconhecida pode ser encontrada.

Objetivo

Determinar a concentração de T4 livre em amostras de soro, pela metodologia de enzimaimunoensaio em microplaca (ELISA competitivo).

Materiais e Métodos

Materiais

Kit Biolisa T4 Livre

Pipetas

Pipeta multicanal

Leitora de ELISA

Papel absorvente

Cronômetro ou relógio.

Frasco para estocar a Solução de Lavagem, após diluída.

Água destilada ou deionizada

Métodos

Realização do teste

1. Separou-se as cavidades que foram utilizadas. Ao todo foram usadas 8 cavidades (2 para amostra e 6 para padrões).
2. Pipetou-se 50 microlitros dos padrões de referência (A-F) e 50 microlitros das amostras nas cavidades determinadas.
3. Pipetou-se 100 microlitros do conjugado em todas as cavidades.
4. Homogeneizou-se a microplaca.
5. Incubou-se a microplaca em temperatura ambiente por 60 minutos.
6. Descartou-se o conteúdo das cavidades.
7. Foi realizada a lavagem das cavidades com a solução de lavagem que foi preparada a partir da diluição da solução concentrada de lavagem. Utilizou-se 300 microlitros na lavagem de cada cavidade, realizando ao todo 5 lavagens. Para lavar as cavidades foi utilizada uma pipeta multicanal. Ao final de cada lavagem, bateu-se a microplaca em papel absorvente a fim de secar a placa.

A solução de lavagem diluída foi preparada da seguinte forma:

260 microlitros (0,26 mL) de solução concentrada de lavagem + 13 mL de água

1. Pipetou-se 50 microlitros de Substrato A em todas cavidades e 50 microlitros de Substrato B em todas cavidades.
2. Homogeneizou-se a microplaca.
3. Incubou-se por 15 minutos em temperatura ambiente, ao abrigo da luz.
4. Pipetou-se 50 microlitros da solução de parada em todas as cavidades.
5. Homogeneizou-se a microplaca.
6. Leu-se em leitor de ELISA (espectrofotômetro) usando os filtros de 450 e 630 nm.

Determinação quantitativa (curva padrão e cálculos)

1. Após a leitura das absorbâncias no leitor de ELISA (espectrofotômetro), os dados das absorbâncias versus a concentração correspondente de cada padrão foram plotados. Traçou-se a curva padrão.
2. A partir da equação da curva padrão, calculou-se a concentração de cada amostra.

Resultado e discussão

Após plotar os dados de absorbância dos padrões X concentração dos padrões, obteve-se a seguinte curva e sua equação.

[pic 1]

Equação: y= -0,0507x + 0,3035

As absorbâncias das amostras foram:

Amostra 1: 0,125

Amostra 2: 0,099

Substituindo y por A (absorbância) e x por [concentração], temos a equação:

A= -0,0507 [concentração] + 0,3035

Desse modo, basta apenas substituir o valor da absorbância de cada amostra e econtrar o valor da concentração de T4 livre.