A Construção do perfil de metilação de indivíduos portadores do transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) utilizando as técnicas de array e MLPA
Por: Luis Oliveira • 29/6/2020 • Tese • 14.224 Palavras (57 Páginas) • 241 Visualizações
Construção do perfil de metilação de indivíduos portadores do transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) utilizando as técnicas de array e MLPA
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências
Programa de Patologia
Orientadora: Profª. Drª. Leslie Domenici Kulikowski
São Paulo 2019
Construção do perfil de metilação de indivíduos portadores do transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) utilizando as técnicas de array e MLPA
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências
Programa de Patologia
Orientadora: Profª. Drª. Leslie Domenici Kulikowski
São Paulo 2019
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Dedico ao meu amado avô, José Matos Machado, que, finalmente, terá uma “neta doutora”.
À Deus, pela vida e pela força para seguir em frente e concluir este trabalho mesmo com tantas dificuldades.
À minha mãe, pelo amor, dedicação, ensinamentos, orações e pelo exemplo de caráter que é para mim.
Ao meu amado avô, José Machado, sempre tão carinhoso e orgulhoso pelas minhas conquistas. E à minha vó, Nelzimar Moura, pelo seu exemplo de coragem e pela ajuda em muitos momentos durante essa jornada.
Ao meu “primo-amigo”, Márcio Arthur, pela amizade, pela empatia, pelo exemplo que é para mim, por me ensinar tanto e, principalmente, pelo seu incentivo constante. E como se não fosse o bastante, agradeço também pela ajuda na ortografia.
À minhas tias, por todo o suporte, orações e carinho durante toda a minha vida. E, especialmente à minha tia Márcia, sempre disposta a ajudar a todos.
À amiga de todas as horas, Fabrícia Madia, pela imensurável ajuda em tudo! E tudo é TUDO mesmo! Sua escuta e seu cuidado foram e são um alento para a alma diante de tantas adversidades. Sua ajuda prática na etapa laboratorial, nas análises dos dados e na confecção da tese foram fundamentais para a realização deste trabalho. Faltam palavras para agradecê-la por sua Amizade e por tudo o que já fez e faz por mim... Um verdadeiro anjo na minha vida!
À minha tão querida orientadora, Drª. Leslie Domenici Kulikowski, (ou simplesmente, “Lé”), por ter confiado em mim desde o início. Pela sua alegria e otimismo contagiantes. Pela sua disposição em ouvir. Pelos conselhos. Pelo incentivo constante. Por, em vários momentos, acreditar em mim mais do que eu mesma. E, especialmente, pela paciência comigo na etapa final. Muito obrigada!
À minha amiga Cintia Milani, por todo o cuidado, carinho e apoio. Por dividir comigo, tão intensamente, muitos momentos – dos melhores aos mais difíceis dessa caminhada. Por fazer parte da minha vida e por fazê-la melhor.
Às amigas Mari Rocha e Lilian Damasceno, pela amizade, pelo apoio, pela compreensão e, claro, pelos cafés! Com vocês a vida em São Paulo era mais doce e alegre.
À amiga Gabriela Pintar, que tanto já havia feito por mim no mestrado e na vida, que ainda me deu uma luz no início deste trabalho e uma enorme ajuda na reta final.
Aos queridos Fábio Marchi e Jullian Damasceno, por toda a ajuda, não somente com as análises bioinformáticas, mas por toda paciência em esclarecer todas as minhas dúvidas
– que não foram poucas!
Às queridas e aos queridos citogenômicos: Roberta, Évelin, Samar, Amanda, Marília, Yanca, Gil, Amom e Alexandre. A ajuda de vocês tornou o trabalho melhor e os dias no laboratório mais divertidos. Vocês são tops!
Ao Dr. Mauro Muszkat, à Drª. Viviane Schuch e ao Núcleo de Atendimento Neuropsicológico Infantil Interdisciplinar (NANI), pela colaboração e por tornarem este trabalho possível.
Ao Dr. Chin Jia Lin, pela disposição em ajudar sempre, desde o meu mestrado.
Ao Departamento de Patologia da FMUSP pela oportunidade e suporte. E, especialmente ao Thiago Rezende pela ajuda e atenção durante esses anos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro ao projeto (2014/02565-8), pela bolsa de estudos a mim concedida (2015/05350-5) e pelas incríveis oportunidades que a mim foram proporcionadas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudos nos dois anos iniciais.
Por fim, agradeço a todos os que contribuíram, de alguma maneira, para a realização deste trabalho.
“E até lá, vamos viver. Temos muito ainda por fazer. Não olhe pra trás. Apenas começamos. O mundo começa agora. Apenas começamos”.
Renato Russo
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RESUMO ABSTRACT
- INTRODUÇÃO 02
- OBJETIVOS 07
- Geral 07
- Específicos 07
- MÉTODOS 08
- Casuística 08
- Seleção amostral 10
- Extração e quantificação de DNA genômico 11
- Arrays de metilação 12
- Análises dos arrays de metilação 13
- Arrays de SNPs 16
- MLPAs 16
- Marcadores de microssatélites 17
- RESULTADOS E DISCUSSÃO 18
- Arrays de metilação 18
- TDAH x Controle (independentemente do sexo) 19
- Meninos x Meninas (independentemente do transtorno) 24
- Análises dos arrays de metilação dos gêmeos 29
- Arrays de SNPs 34
- MLPAs 36
- CONCLUSÕES 37
- ANEXO 38
- REFERÊNCIAS 41
Costa TVMM. Construção do perfil de metilação de indivíduos portadores do transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH) utilizando as técnicas de array e MLPA [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2019.
O Transtorno do Déficit de Atenção e Hiperatividade (TDAH) é uma síndrome comportamental comum que se inicia na infância e afeta aproximadamente 5,3% de crianças em todo o mundo. Devido à sua complexidade etiológica, até o momento não foram encontrados marcadores biológicos consistentes para o TDAH. Entretanto, a alta herdabilidade que o transtorno apresenta indica uma forte influência de fatores genéticos. Estudos recentes têm apontado para o envolvimento de processos epigenéticos na etiologia do TDAH. Um dos principais mecanismos epigenéticos é a metilação do DNA, que geralmente está relacionada ao silenciamento transcricional de genes em ilhas CpGs, as quais podem estar associadas aos promotores gênicos, aos corpos dos genes e às regiões 5’ e 3’ UTRs (untranslated regions). Desta forma, investigamos se as alterações genéticas do TDAH podem estar relacionadas à metilação do DNA através da construção de perfis de metilação de DNA do sangue periférico. Neste trabalho, recrutamos indivíduos (n=29) entre 06 e 14 anos de idade com diagnóstico clínico de TDAH para participar do estudo. O recrutamento foi realizado no Núcleo de Atendimento Neuropsicológico Infantil Interdisciplinar (NANI), da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP). Crianças de 06 a 11 anos (n=11) com diagnóstico clínico negativo para o TDAH também foram selecionados para o estudo como controles. Amostras de sangue periférico de indivíduos com e sem TDAH foram coletadas para a extração de DNA linfocitário e posterior realização das técnicas de array de metilação, array de SNPs e MLPA de metilação. Os dados obtidos dos arrays de metilação foram tratados e analisados utilizando-se pacotes específicos no R. Os arrays de SNPs foram analisados no BlueFuse. Já os dados dos MLPAs de metilação foram analisados no GeneMarker. Dentre os resultados, podemos destacar a via “Dopaminergic synapse” como um achado importante obtido pelo enriquecimento realizado com base nas análises comparativas dos arrays de metilação entre os grupos TDAH e Controle. Tal achado corrobora com outros estudos cujas evidências indicam forte associação genética entre vias dopaminérgicas e o TDAH. Desta maneira, torna-se fundamental a realização de novos estudos epigenéticos para nos permitir uma melhor compreensão do papel da metilação do DNA na etiologia do TDAH.
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