A Caracterização Funcional e Bioquímica

Caracterização funcional e bioquímica da interação entre Integrina beta 1 (Itgβ1) e Imunoglobulina 3 de camundongo (IgG3).

Diane S. Lima De Oliveira1, Verenice Paredes2, Ananésia Correa Dos Santos2, Patrícia Albuquerque1, Arturo Casadevall3, Maria Sueli Soares Felipe4, André Moraes Nicola1,2.

1 Universidade de Brasília, Brasil,

2 Karan Technologies, Brasília, Brasil.

3 Universidade Johns Hopkins, Baltimore, MD

Palavras-chave: IgG3; itgb1; receptor; interação.

Introdução

O IgG3 é o principal isotipo a ser produzido contra carboidratos e epítopos em repetição, o que sugere importância no combate de algumas infecções fúngicas. Apesar de apresentar função protetora, IgG3 foi o único isotipo entre os anticorpos monoclonais contra Cryptotcoccus neoformans a apresentar também papel agravante de doença ou não protetor em camundongos infectados tratados com o anticorpo. Ambos os mecanismos saúde/doença mediados por IgG3 ainda não foram elucidados, apesar de há mais de 30 anos ter sido proposto que IgG3 apresenta receptor distinto dos demais isotipos. Estudo mais recente e não publicado envolvendo colaboração com o grupo de pesquisa do Dr. Arturo Casadevall, revelou a integrina beta 1 como um importante efetor na resposta contra C. neoformans mediada por IgG3. A integrina se ligou ao IgG3 monoclonal de hibridoma (denominado 3E5) consideravelmente em ensaios funcionais, evidenciando importante papel protetor em macrófagos peritoniais de camundongos e mesmo em células que não são fagócitos profissionais (células de ovário de hamster chinês e pneumócitos humanos). Portanto, evidências sugerem que a integrina seja o provável receptor de IgG3 até então desconhecido. Este trabalho objetiva reproduzir os ensaios funcionais realizados pelo grupo do Dr. Casadevall, assim como caracterizar as interações bioquímicas entre itgb1 e IgG3 para elucidar o mecanismo saúde/doença mediado pelo anticorpo.

Métodos e resultados

Um par de anticorpo contra C. neoformans (2H1) e outro contra molécula de Isotiocianato de fluoresceína (4420) foram produzidos por clonagem da cadeia variável leve e pesada em vetores plasmidiais (Invivogen), contendo a cadeia constante leve e pesada de IgG1 e IgG3. Os vetores de cadeia leve e pesada foram cotransfectados em célula NSO adaptada à suspensão e o cultivo foi escalonado até 1 litro em meio livre de soro. De forma semelhante foi produzida a integrina recombinante solúvel. Os sobrenadantes foram purificados por cromatografia de afinidade a proteína G e ultraconcentrados em até 2 ml. Os anticorpos 2H1-IgG1 (900 µg/ml), 2H1-IgG3 (35 µg/ml), 4420-IgG1 (100 µg/ml) e 4420-IgG3 (50 µg/ml) foram quantificados por ELISA, nanodrop e SDS-PAGE. Ambos os pares foram funcionais em ensaio de fagocitose por macrófagos J774.1 (2H1-IgG1: 46%, 2H1-IgG3: 39%, 4420-IgG1: 27%, 4420-IgG3: 30%) e em ensaio de imunofluorescência indireta (apenas par 2H1 foi testado). O par 2H1 apresentou menor porcentagem fagocítica quando o receptor FcRγ quando foi bloqueado (IgG1:3%, IgG3: 17%), do que quando itgb1 foi bloqueado (IgG1:39%, IgG3:32%). O 4420-IgG1 apresentou resultado semelhante ao par 2H1 (em bloqueio FcRγ: 13%; em bloqueio itgb1:18%), enquanto 4420-IgG3 apresentou porcentagens semelhantes nas condições de bloqueio de FcRγ (18%) e itgb1 (15%). Os controles e análises estatísticas validaram os experimentos (P <0,0001). Ensaio de fase sólida com par de anticorpo produzido por hibridoma (3E5-IgG3 e 3E5-IgG2a) e ascite em camundongos; e par de anticorpo comercial (MOPC21-IgG1 e FLOPC21-IgG3), revelou interação apenas de 3E5-IgG3 com itgb1 recombinante solúvel. Os controles também validaram este último ensaio.

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