A DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

LUCIANO RODRIGUES DE ALMEIDA GRR20191044

DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS

Relatório apresentado no curso de Engenharia de

Bioprocessos e Biotecnologia, da aula prática da

disciplina de Bioquímica, na Universidade Federal

do Paraná, setor Palotina.

Professor(a): Marise Fonseca.

PALOTINA

2021DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS

INTRODUÇÃO

O termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir a

intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de

medida é utilizada a espectrofotometria que se baseia na absorção da radiação nos

comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. O aparelho

espectrofotômetro faz passar um feixe de luz monocromática através de uma

solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. Um prisma

contido no aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda.

Assim é possível passar um feixe de luz monocromática através da amostra. O

Equipamento permite saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento

de onda. O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda para um

composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância.

Como diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a

espectrofotometria permite identificar e quantificar substâncias com base no seu

espectro. A quantificação é realizada com a relação entre quantidade de luz

absorvida e concentração da substância. A absorção da luz é tanto maior quanto

mais concentrada for a solução por ela atravessada e quanto maior for a distância

percorrida pelo feixe luminoso através da amostra. Esses princípios formam a Lei de

Lambert –Beer Para determinação da concentração de um soluto em uma amostra

por espectrofotometria, temos a comparação da absorbância da amostra com uma

solução padrão, na qual já é conhecida a concentração do soluto. Em geral, é

utilizada uma solução-padrão com diferentes concentrações (padrões de referência),

que tem sua absorbância determinada. Esses padrões são preparados diluindo-se a

solução-padrão na proporção necessária para a obtenção das concentrações

desejadas. Com os valores de absorbância e de concentração conhecidos, pode-se

traçar um gráfico cujo perfil é conhecido como “curva-padrão” ou “curva analítica”.

Nesse gráfico, a reta indica a proporcionalidade entre o aumento da concentração e

da absorbância e a porção linear correspondente ao limite de sensibilidade do

método espectrofotométrico para o soluto em questão.Objetivo

Abordar a espectrofotometria como método analítico na determinação da

concentração.

Parte Experimental

Inicialmente a prática foi iniciada preparando solução diluída da amostra, foi

pipetado 100µL de soro e após isso foi adicionado 900µL da solução salina NaCl

0,9%, agitado levemente para finalizar.

Após isso foram preparado 6 tubos conforme a tabela 1 apresenta abaixo

Tabela 1

Tubos Padrão 5 mg/mL(µL) Água(µL) Soro Diluído(µL)

Branco (B) - 100 -

1 25 75 -

2 50 50 -

3 75 25 -

4 100 - -

A - - 100

A solução todas foram transferidas em triplicata. Após a preparação de todos

os tubos foram adicionados aos mesmos 200µL do reagente de Biureto.

A placa de elisa com os tubos foi incubada a 32ºC na estufa durante 10 minutos.

Após isso foi colocado a placa no espectrofotômetro para leitura das placas, a leitura

foi feita utilizando um computador juntamente com o programa adequado.

A leitura foi feita a λ= 540 nm, onde se obteve os dados da tabela 2 conforme

apresentada abaixo:

Tabela 2

1 2 3

A 0,000 0,000 0,000B 0,100 0,110 0,120

C 0,230 0,220 0,210

D 0,320 0,340 0,330

E 0,430 0,440 0,450

F 0,290 0,280 0,300

De acordo com os resultados da tabela acima, foi montado um gráfico

correlacionando o comprimento de onda com absorbância, de acordo com o gráfico

abaixo podemos notar que o tubo 5 teve pornot máimo de absorbância

A curva padrão foi realizado seguindo os dados da tabela 3 abaixo:

Tabela 3

Quantidade de proteína (µg) Absorbância

125 0,11

250 0,22

317 0,3

375