A Extração de Enzimas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE CURSO DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA II

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EXTRAÇÃO DA ENZIMA INVERTASE DE LEVEDURA (Saccharomyces cerevisiae) E AVALIAÇÃO DA CINÉTICA ENZIMÁTICA

Gustavo Ribeiro Ignácio (87164)

Lígia Rezende Hirata (87152)

Rio Grande, 2016

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Relação entre concentração de substrato e velocidade inicial.        5

Figura 2 - Gráfico duplo recíproco de Lineweaver-Burk.        6

Figura 3 - Curva padrão de glicose.        10

Figura 4 - Gráfico de Michaelis-Menten.        11

Figura 5 - Gráfico de Lineweaver-Burk.        12

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Dados das soluções reagentes utilizadas para a construção da curva padrão de glicose (primeira linha corresponde ao branco da reação).        8

Tabela 2 - Dados de volume das soluções e tempo utilizados para a realização das reações com o extrato enzimático.        9

Tabela 3 - Absorbância, concentração inicial de substrato e velocidade inicial de cada ensaio.        10

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO        4

2 OBJETIVOS        7

3 MATERIAL E MÉTODOS        7

3.1 Material        7

3.2 Reagentes e Soluções        7

3.3 Procedimento Experimental        7

3.3.1 Extração da enzima invertase de Saccharomyces cerevisiae.        7

3.3.2 Preparo da curva padrão de glicose.        8

3.3.3 Estudo da cinética enzimática: Efeito da concentração de substrato na velocidade da reação enzimática.        8

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO        9

5 CONCLUSÃO        14

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS        14

RESUMO

O experimento teve como objetivo a determinação e avaliação dos parâmetros cinéticos para a reação de hidrólise enzimática da sacarose. Foram preparadas diversas soluções com diferentes concentrações de sacarose para desenvolverem uma reação enzimática promovida pela enzima invertase. Após a reação o produto liberado (glicose) foi estimado através de uma leitura de absorbâncias com o reagente apropriado e com base em uma curva padrão de glicose feita separadamente. Assim, os valores de produto liberado por minuto (velocidade inicial) e a concentração inicial de substrato foram calculados e um gráfico de Michaelis-Menten foi construído, porém, como o tipo de curva do gráfico não permite muitas vezes obter os parâmetros cinéticos Km e Vmáx, foi necessária a utilização de outra metodologia: o método dos duplos recíprocos ou de Lineweaver-Burk. A partir desse gráfico obteve-se a equação da reta através da qual pôde-se extrair os valores do coeficiente de x e da constante da equação, os quais correspondem respectivamente à valores da equação para o cálculo dos parâmetros. Sendo assim, achou-se valores de -4  e para Vmáx e Km respectivamente e foram elucidados os efeitos desses parâmetros em reações que seguem a cinética de Michaelis-Menten.[pic 3][pic 4][pic 5]

Palavras chave: parâmetros cinéticos; Km e Vmáx; Michaelis-Menten;

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1 INTRODUÇÃO

        Invertases ou β-frutofuranosidades são enzimas capazes de quebrar a sacarose, um dissacarídeo, em seus monômeros constituintes: glicose e frutose. Comumente chamada apenas por invertase, seu nome deve-se ao fato de que a hidrólise da sacarose leva à inversão da rotação óptica do meio reacional (KOBLITZ, 2010).

        A sacarose é um dissacarídeo não-redutor, formado por uma unidade de glicose e uma de frutose, ligadas entre si por ligação glicosídica. É o principal açúcar comercializado no mundo e suas maiores fontes são a cana-de-açúcar e a beterraba. A sacarose é considerada o padrão de doçura na indústria de alimentos, tal que o poder edulcorante de outras substâncias é determinado em relação a ela (KOBLITZ, 2010).

        O produto da hidrólise da sacarose, o xarope de glicose-frutose, conhecido como “açúcar invertido”, apresenta diversas características interessantes em relação ao xarope de sacarose, dentre as quais o maior poder edulcorante (devido a presença da frutose), maior possibilidade de concentração (os monossacarídeos formados são mais solúveis que a sacarose), ponto de ebulição mais alto e ponto de congelamento mais baixo (em virtude da maior pressão osmótica do produto) e várias aplicações na indústria de alimentos. No entanto, a obtenção de açúcar invertido é mais facilmente alcançada pela aplicação de resinas catalíticas (hidrólise ácida), sendo a hidrólise enzimática pouco utilizada para esse fim (KOBLITZ, 2010).

        Além da atividade hidrolítica, invertases podem apresentar atividade de transferases, sendo capazes de remover a unidade de frutose do substrato (sacarose) e de a ligar a diferentes aceptores em diferentes posições. Essa atividade de transferases confere às invertases a sua principal aplicação industrial, no que diz respeito à obtenção de oligossacarídeos funcionais. Ainda que a qualidade de transferases seja a mais explorada industrialmente, o conhecimento da atividade hidrolítica é muito importante, principalmente quando não se possuem substratos puros, fazendo com que a hidrólise ácida não seja tão eficiente e seja necessária a aplicação de hidrólise enzimática. Portanto é interessante conhecer a atividade hidrolítica de invertases, que pode ser determinada, por exemplo, por quantificação de açúcares redutores liberados, por quantificação de glicose liberada durante a reação ou por acompanhamento de inversão de rotação óptica do meio reacional, em polarímetro (KOBLITZ, 2010).