O Protocolo de Extração de DNA

Protocolo para extração de DNA (Sangue)

• Ligar a UV por 15 minutos (Ponteiras, pipetas, descartex).
• Ligar o banho a seco à 56ºC.
• Identificar os tubos com etiquetas: NOME, REGISTRO DO LIVRO, PRONTUÁRIO e DATA.

1. Foram utilizadas 10 amostras de sangue anticoaguladas com EDTA, e 5 mL de cada amostra foram colocados em cinco tubos de vidro de 10 mL.
2. Em seguida, 8 mL de tampão de lise (0,3 M de sacarose, 0,01 M de TrisHCl, pH 7,5, 5 mM de MgCl2, 1% Triton X100) foram adicionados a cada tubo.
3. Os tubos foram centrifugados por 5 minutos a 2.500g.
4. O sobrenadante foi descartado e 300m1 de TrisHCl 10 mM, pH 8, foi adicionado aos peletes.
5. Os pellets foram liberados do fundo dos tubos e transferidos rapidamente para tubos de microcentrífuga frescos.
6. O sedimento foi ressuspenso por agitação vigorosa e o produto foi centrifugado por 1 min a 700g.
7. Após o descarte do sobrenadante, 330mL de TrisHCl 10 mM, pH 8; 330mL de lavanderia solução em pó (concentrações: 20, 25, 30, 35 e 40 mg/mL); e um grânulo de vidro foram adicionados a cada tubo.
8. As amostras foram agitadas em vórtex por 1 min, 250mL de NaCl 6M foi adicionado e eles foram agitados novamente por 20 segundos.
9. Em seguida, os tubos foram girados por 5 minutos a 15.000g.
10. O sobrenadante foi transferido para tubos frescos (cerca de 750mL) e o DNA foi precipitado pela adição de 750mL de etanol 96%.
11. O precipitado de DNA foi recuperado usando uma pipeta de vidro de extremidade fina selada a quente, lavada duas vezes em 0,5 mL de etanol a 70% e finalmente dissolvido em 100mL de TrisHCl 10 mM, pH 8.
12.  O precipitado foi completamente dissolvido por incubação a 701C por 5 minutos.

...