Relatório de Extração de DNA

Universidade Federal do Vale do São Francisco – UNIVASF

Discente: Marina Tito Pereira Rocha

Disciplina: Genética Molecular

Docente: Michely Correia Diniz

Extração de DNA de células bucais

Introdução

        “As técnicas de otimização de extração de DNA (...) permitem a investigação diagnóstica em diferentes amostras biológicas, mesmo quando o DNA está presente em pequenas quantidades. Resquícios de saliva, esfregaço bucal, sangue, bulbos capilares, tecidos incluídos em parafina, ossos, gotas de esperma, entre outros, podem fornecer informações importantes, desde que analisados de forma adequada.” (SIMONATO, et al, p. 121-7, 2007)¹

        “Células bucais são fontes convenientes de DNA para diagnóstico e estudos epidemiológicos. O presente estudo teve como objetivo desenvolver um método simples e prático para obter células epiteliais, através de bochechos, a fim de serem usadas como fonte de DNA, avaliar a estabilidade do DNA na solução de bochecho no decorrer do tempo (...)” (AIDAR, et al, p.1, 2016)²

Objetivo

        A finalidade da prática realizada foi passar o conhecimento sobre a técnica didática de extração de DNA do interior das células bucais, de forma que o torne visível a olho nu para os alunos.

Materiais e Métodos

        Os materiais utilizados foram copos descartáveis, espátula de madeira, centrífuga, solução de sacarose, solução de NaCl, solução de SDS, agitador vortex, banho maria, isopor, bolsas de gelo, dois tubos de ensaio com tampas, álcool, água destilada e micropipeta.

        Primeiramente foi colocado água destilada em um copo descartável, e feito o bochecho para higienizar a boca, essa água foi descartada. Então, utilizando a espátula de madeira, foi raspada delicadamente a mucosa bucal, a fim de se retirar algumas células. Em seguida, colocou-se cerca de 15ml de água destilada no copo, feito novamente o bochecho por 30 segundos, de forma vigorosa, e recolhido o volume obtido do bochecho no mesmo copo e mexido com a espátula, para que as células que estavam fixadas fiquem na solução.

        A solução do copo foi transferida para um tubo de ensaio com tampa e levado à centrífuga, a 4000rpm por 5 minutos, a fim de peletizar as células no tubo. Após esse processo, foi descartado o sobrenadante, colocado 500µl de sacarose e homogeneizado utilizando o agitador vortex por aproximadamente 1 minuto. Então a solução foi aquecida a 65°C no banho maria por cinco minutos, e logo após foi colocada num isopor contendo bolsas de gelo por mais 5 minutos.

        Posteriormente, foi adicionado 300µl de NaCl 2M e misturado no vortex, e adicionado mais 500µl de SDS 2%, e novamente homogeneizado. Essa solução foi levada à centrífuga a 4000 rpm por 10 minutos.

        O sobrenadante foi colocado em outro tubo, e no tubo anterior, que ficou peletizado, colocou-se 1,5ml de ácool gelado, com a micropipeta, de forma lentamente e pelas bordas do tubo.

        Centrifugou-se mais uma vez a solução, a 4000rpm por 10 minutos, retirado o sobrenadante, recolhido o DNA e ressuspendido em 100µl de água destilada.

Conclusão

        A utilização da centrífuga durante os passos do experimento foi para que os componentes presentes na solução do bochecho fossem separados via sedimentação dos líquidos de diferentes densidades, por isso o resultado era um corpo de fundo no tubo, constituído pelos componentes das células bucais.

        O DNA foi ressuspendido em solução de sacarose para que houvesse a separação das partículas das células, suas organelas; foi aquecido a 65° C porque o aumento da temperatura aumenta a energia cinética entre as moléculas favorecendo a solubilização das membranas pela sacarose, além de provocar a desnaturação térmica de várias proteínas e enzimas, como por exemplo, as DNAses, que podem degradar o DNA.

        Após submeter a solução a alta temperatura, foi em seguida colocada no gelo, causando o choque térmico, que é o processo responsável pela diminuição rápida da temperatura do sistema, e serve para manter “inativadas” as proteínas e as enzimas.