Técnica de Gram

Introdução

A técnica de Gram., também conhecida como coloração de Gram., é um método de coloração de bactérias desenvolvido pelo médico Dinamarquês Hans Christian Joachim Gram. (1853-1938), em 1884, o qual permite diferenciar bactérias com diferentes estruturas de parede celular a partir das colorações que estas adquirem após tratamento com agentes químicos específicos. O método consiste em tratar sucessivamente um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes de cristal de violeta, lugol, etanol-acetona e fucsina básica. As bactérias que adquirem a coloração azul violeta são chamadas de Gram-positivas e aquelas que adquirem a coloração vermelha são chamadas de Gram-negativas. O método da coloração de Gram. é baseada na capacidade das paredes celulares de bactérias Gram-positivas de reterem o corante cristal de violeta no citoplasma durante um tratamento com etanol- acetona enquanto que as paredes celulares de bactérias Gram-negativas não o fazem. A coloração de Gram. é um dos mais importantes métodos de coloração utilizados em laboratórios de microbiologia e de análises clínicas, sendo quase sempre o primeiro passo para a caracterização de amostras bacterianas. A técnica tem importância clínica uma vez que muitas bactérias associadas a infecções são prontamente observadas e caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas em esfregaços de pus ou de fluidos orgânicos. Essa informação permite ao clinico, monitorar a infecção até que dados de cultura estejam disponíveis. É possível a análise de vários esfregaços por lâmina, o que facilita a comparação de espécies clínicas. As lâminas podem ser montadas de forma permanente e preservados como documentação. O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal de violeta, seguido de tratamento com um fixador, lugol. Tanto bactérias Gram-positivas, quanto as Gram-negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma coloração violeta, devido a formação de um complexo cristal de violeta-iodo, insolúvel, em seu citoplasma. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células. Por otro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-positivas e provoca a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao complexo, o corante provoca a remoção do cristal de violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuros e as Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas, células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as células coradas como Gram-negativas. Portanto, o uso de

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