Técnicas de semeadura, isolamento e contagem dos micro-organismos.

Universidade Federal do Recôncavo da Bahia
Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas
Profa. Maria Gardenny Ribeiro Pimenta
Disciplina de Microbiologia Geral[pic 1]

Relatório: Técnicas de semeadura, isolamento e contagem dos micro-organismos.

Cruz das Almas – Bahia

Julho de 2017

Itan Rocha Miranda

Rafael Nunes

Saulo Silva Batista

Tainan da Silva Batista

Relatório apresentado como requisito

parcial de avaliação da disciplina

Microbiologia, ministrada pela.

Prof.ª Maria Gardenny 

Cruz das Almas – Bahia

Julho de 2017

1. Introdução.

      Existem diferentes métodos para quantificar o crescimento de uma população microbiana. Alguns métodos determinam o número de células enquanto outros analisam a massa total da população, que é diretamente proporcional ao número de células. A quantificação de uma população geralmente é realizada considerando o número de células em um mililitro do meio líquido ou um grama do material sólido. Como normalmente populações bacterianas são muito grandes, são utilizadas pequenas amostras dessas para contagem por meio de métodos diretos ou indiretos. O tamanho total de uma população é, então, determinado utilizando fórmulas matemáticas para o cálculo desses valores.

    Essa praticidade é decorrente do princípio do método, que se baseia na premissa de que cada célula microbiana presente em uma amostra irá formar,  quando  fixada em um meio de cultura sólido adequado, uma colônia visível  e isolada. Variando o tipo de meio (meio de enriquecimento, meio seletivo, meio  seletivo-diferencial) e as condições  de encubação (temperatura e atmosfera),  é possível selecionar o grupo, gênero ou espécie que se deseja contar.

    2. Objetivos.

 ∙ Diluir a amostra empregando a técnica de diluição seriada;

 ∙ Realizar a inoculação da amostra em placa de Petri utilizando a técnica de semeadura em profundidade;

 ∙ Aprender a técnica de semeadura por esgotamento em meio sólido vertido em placa;

 ∙ Transferir inóculo do meio sólido para líquido.

• Realizar a contagem de bactérias mesófilas (UFC/ml);

 ∙ Retirar colônia isolada após contagem das placas;

 ∙ Estriar placas por esgotamento em quadrantes.

1. Materiais.

 ∙ Ponteiras de 1 ml estéril;

 ∙ Placa de Petri estéril;

 ∙ Pipeta automática de 1000 ml;

 ∙ Lamparina de álcool;

 ∙ Chapa aquecedora;

 ∙ Agitador de tubos tipo Vortex;

 ∙ Caneta para marcar vidraria;

 ∙ Recipiente para descarte de ponteiras;

 ∙ Ágar Padrão para Contagem (PCA) (HIMEDIA);

 ∙ Ágar Citrato de Simmons (HIMEDIA);

 ∙ Caldo Lactose (HIMEDIA);

 ∙ Placa de Petri com meio PCA;

 ∙ Alça de platina;

 ∙ Solução Salina 0,85% (NaCl);

 ∙ Tubo estoque com micro-organismo;

 ∙ Amostra.

 ∙ Álcool 70%;

 ∙ Estante para tubos de ensaio;

 ∙ Papel toalha;

 ∙ Recipiente para descarte dos tubos e placas;

1. Procedimentos.

4.1 Semeaduras em profundidade.

4.2 Diluição da amostra.

• Transferir 25 ml da amostra para 225 ml de solução salina 0,85% (10-1);
•  Retirar 1 ml da diluição 10-1 para um tubo com 9 ml de solução salina 0,85% (10-2 );
•  Repetir o procedimento para as outras diluições subsequentes até a diluição 10-5;
•  Homogeneizar cada diluição em agitador de tubos tipo Vortex.

4.3 Plaqueamento.

 ∙ Transferir 1 ml de cada diluição para placa de Petri estéril;

 ∙ Verter 15-20 ml de ágar fundido (44 a 46 °C) na placa de Petri;

 ∙ Homogeneizar as placas com movimentos suaves rotatórios (em forma de     oito), para melhor mistura da amostra com o meio de cultura;

 ∙ Esperar solidificar;

 ∙ Inverter as placas e incubar a 35±1 °C por 48±2 horas.

4.4 Semeaduras em meio sólido inclinado (esgotamento).

 ∙ Retirar inóculo de meio estoque com auxílio da alça de platina;

 ∙ Depositar o inóculo sobre a superfície do ágar Citrato de Simmons inclinado, fazendo estrias no ágar com alça de platina;

 ∙ Inverter as placas e incubar a 35±1 °C por 96±2 horas.

4.5 Semeaduras no meio líquido.

 ∙ Retirar o inóculo do meio estoque;

 ∙ Transferir para o meio líquido o inóculo, com auxílio da alça de platina;

 ∙ Incubar o material a 35±1 °C por 48±2 horas.

4.6 Procedimentos referentes à contagem.

 

4.7 Semeaduras em Profundidade.

4.8 Contagem e cálculo dos resultados.

 ∙ Selecionar as placas correspondentes à diluição com número de colônias entre 25 e 250 colônias, preferencialmente;

 ∙ Contar as colônias das placas com diluições correspondentes;