A EXTRAÇÃO E PRECIPITAÇÃO DA ENZIMA MALTASE DE LEVEDURA

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E QUÍMICA ORGÂNICA - DBQO 

DISCIPLINA PRÁTICA DE BIOQUÍMICA GERAL E EXPERIMENTAL II

CURSO DE GRADUAÇÃO EM QUÍMICA – 2022

PRÁTICA I – PURIFICAÇÃO DA ENZIMA MALTASE DE Saccharomyces cerevisiae: PREPARAÇÃO DO EXTRATO PROTÉICO CONTENDO A ENZIMA

A maltase é uma enzima que catalisa a hidrólise do dissacarídeo maltose, liberando moléculas de glicose, a qual pode ser metabolizada até etanol, pela glicólise seguida de fermentação. Vários micro-organismos produzem essa enzima, destacando a levedura Saccharomyces cerevisae, tradicionalmente conhecida como “fermento de pão”. A atividade desta enzima é muito importante para o sucesso na produção de cerveja, pois os principais açúcares fermentados pela levedura são a maltose, seguido da maltotriose e glicose.

A purificação de uma proteína é uma etapa importante para os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas. Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. A precipitação de proteínas pode ser induzida por adição de sais, de solventes ou variação de pH (precipitação isoelétrica). Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes.

[pic 3]Obs: TODAS AS ETAPAS DESTE ROTEIRO DEVEM SER REALIZADAS EM BANHO DE GELO!

PROCEDIMENTO 1: OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO (EB)

a) Suspender 30 g de levedura fresca em 40 mL de tampão fosfato 100 mmol/L pH 7,0 gelado. b) Homogeneizar no vórtex e lavar as células de levedura centrifugando a 4.000 rpm por 10 min a 4°C. Descartar cuidadosamente o sobrenadante. Realizar esta etapa por 2 vezes (2 lavagens). c) Descartar cuidadosamente o sobrenadante e suspender o sedimentado em 5 mL de solução tampão de lise (tampão fosfato 100 mmol/L pH 7,0 com EDTA 5 mmol/L) gelada. Homogeneizar no vórtex. d) Adicionar 50 μL de PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonila) 100 mmol/L, previamente preparado em etanol. e) Homogeneizar novamente em vórtex.

f) Verter a suspensão de leveduras em um almofariz gelado contendo 10 g de AREIA lavada e seca e pulverizar durante 5 min em banho de gelo (LISE CELULAR).

g) Transferir o lisado celular para um tubo de centrífuga gelado, com auxílio de uma pipeta. h) Lavar o almofariz com 5 mL de solução tampão de lise gelado e verter este conteúdo no tubo de centrífuga contendo o lisado celular.

i) Centrifugar a 20.000 rpm por 10 minutos a 4°C.

j) Transferir o sobrenadante para um tubo Falcon de 50 mL graduado, previamente identificado como EXTRATO BRUTO (EB) e determinar o volume obtido.

k) Transferir uma alíquota de 2,0 mL do extrato bruto para um tubo eppendorf de 2,0 mL, rotular adequadamente e reservar no banho de gelo (OBS: este tubo deve ser identificado com o NÚMERO DO GRUPO e TURMA e será armazenado em freezer a –20°C para as próximas aulas).

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PROCEDIMENTO 2: PRECIPITAÇÃO DAS PROTEÍNAS TOTAIS DO EXTRATO BRUTO COM SULFATO DE AMÔNIO

a) Precipitar as proteínas totais do extrato bruto (PROCEDIMENTO 1, tubo Falcon, linha j) adicionando lentamente sulfato de amônio, na proporção de 5,0 g de sulfato de amônio para cada 10 mL de extrato proteico, sob agitação branda em banho de gelo, durante uma hora (60 min).

b) Após a adição do sal, manter a solução sob agitação lenta por 14 a 16 h (overnight), em banho de gelo, para uma precipitação eficiente

AS ETAPAS SEGUINTES SERÃO REALIZADAS PELO TÉCNICO DO LABORATÓRIO c) Centrifugar a 20.000 rpm por 20 min a 4ºC.

e) Coletar o sobrenadante em um tubo Falcon limpo e identificar como FRAÇÃO S – a fração Sobrenadante (OBS: este tubo deve ser identificado com o NÚMERO DO GRUPO e TURMA e será armazenado em freezer a –20°C para as próximas aulas).

f) Dissolver o precipitado em solução tampão fosfato 100 mmol/L pH 7,0 na proporção de 2 volumes de solução tampão para um volume de precipitado e identificar devidamente o tubo como FRAÇÃO P solubilizada