A Separação e Purificação de Produtos Biotecnológicos

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI

Separação e Purificação de Produtos Biotecnológicos

Dosagem da atividade enzimática após precipitação com solvente orgânico para amostras provenientes do rompimento através de moinho de bolas e permeabilização celular.

Késia D’Ávila Pereira Fernandes

Yuri Bolognani de Oliveira

Resumo

A precipitação de biomoléculas de interesse em meios aquosos é um dos métodos mais tradicionais de concentração e purificação. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo principal avaliar a eficiência da precipitação por solvente orgânico em amostras de Saccharomyces cerevisiae após rompimento celular por moinho de bolas e permeabilização, através da dosagem da atividade enzimática da invertase.

As amostras foram tratadas com 29% (v/v) de etanol, mantidas em banho de gelo por 20 minutos e, então centrifugadas, repetindo-se esse procedimento. Separou-se alíquotas referentes aos sobrenadantes e pellets, a fim de dosar a atividade enzimática.

Para a avaliação da atividade da invertase, utilizou-se o método de DNS: adicionou-se sacarose 0,1 M (substrato para a enzima), tampão acetato 100 mM pH 5, frações de amostra, DNS e água destilada. Em seguida, realizou-se a leitura de absorbância a 540 nm em todas as amostras, a fim de quantificar, indiretamente, a invertase.

Através da análise dos resultados de atividade enzimática obtidos, pôde-se concluir que o procedimento de precipitação com solvente orgânico foi eficaz, uma vez que o fator de purificação referente aos pellets foi superior ao dos sobrenadantes, indicando que houve a precipitação da enzima de interesse.

Palavras-chave: precipitação com solvente orgânico, atividade enzimática, invertase.

Introdução

A precipitação seletiva de uma proteína a partir de uma solução aquosa é um dos passos de isolamento mais antigos, mais eficazes e tecnicamente simples utilizados na purificação de proteínas. A solubilização de proteínas precipitadas pode ser avaliada de modo a diminuir o volume inicial da amostra e, consequentemente, elevar sua concentração. Desta forma, não é incomum que a precipitação de proteínas seja usada como o passo de isolamento inicial de muitos procedimentos de purificação (TIMERMAN, 2012).

Os agentes precipitadores de proteína são divididos em três classes: sais, solventes orgânicos e polímeros de cadeia longa. Os solventes orgânicos diminuem a constante dielétrica da solução e, consequentemente, reduzem a capacidade de solvatação da água nas regiões carregadas e hidrofílicas da superfície da proteína. Assim, a favorabilidade relativa das interações proteína-proteína aumenta, ocasionando a precipitação (MCPHERSON, 2004).

Pelo mesmo mecanismo, os solventes orgânicos causam mudanças conformacionais nas proteínas, levando a uma diminuição da estabilidade proteica. Nesse tipo de precipitação, a temperatura, o pH e a concentração de solvente são fatores fundamentais na determinação de uma condição satisfatória de trabalho a fim de alcançar baixa perda por desnaturação (KILIKIAN & PESSOA JR, 2005).

A invertase (β-frutofuranosídeofrutohidrolase, EC 3.2.1.26), enzima a ser precipitada e quantificada no presente trabalho, catalisa a hidrólise da sacarose em glicose e frutose. O ensaio de detecção dessa enzima é tipicamente realizado perto de seu pH ideal (4.8) e temperatura (40°C) (TIMERMAN, 2012). A quantificação indireta da atividade enzimática de uma proteína é obtida com relativa facilidade (KILIKIAN & PESSOA JR, 2005).

Neste contexto, um método para determinação indireta da invertase é a quantificação de açúcares redutores, baseada na capacidade de o ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) ser reduzido pela sacarose, após ser hidrolisada, a composto nitroamino análogo, altamente colorido. Esse composto absorve luz, tornando possível estabelecer uma relação direta entre a medida colorimétrica e a quantidade de açúcar redutor presente (VASCONCELOS et al., 2013).

 O presente trabalho teve como objetivo avaliar, através da dosagem enzimática da invertase, a eficiência da precipitação dessa proteína utilizando etanol 29% (v/v).

 

Procedimento Experimental

        Após o rompimento celular das suspensões de Saccharomyces cerevisiae a 0,35g mL-1 em tampão fosfato 50 mM e pH 7 pelos métodos de moinho de bolas e permeabilização, separou-se uma alíquota de cada amostra, a fim de dosar a atividade enzimática.

        Ao que restou das amostras, adicionou-se 29% (v/v) de etanol, agitando-as e colocando-as em banho de gelo por 20 minutos. Ambas as amostras foram centrifugadas: 10700 rpm, 7 min e sem refrigeração, para a do moinho de bolas e 5000 rpm, 15 min e 4ºC para a de permeabilização. Desta forma, obteve-se sobrenadante e pellet. Retirou-se outra alíquota dos sobrenadantes, a fim de dosar a atividade enzimática. Os pellets foram ressuspendidos adicionando-se 4 vezes seu volume de tampão fosfato 50 mM pH7, homogeneizando-os.        Realizou-se o mesmo procedimento com os sobrenadantes obtidos da primeira centrifugação. Os pellets foram ressuspendidos, adicionando-se 3 vezes seu volume em tampão fosfato 50 mM pH 7, homogeneizando-os. Separou-se os sobrenadantes e pellets, a fim de dosar atividade enzimática.

        Após a precipitação com etanol, identificou-se 7 tubos de ensaio, de acordo com a Tabela 1. A cada tubo, adicionou-se 125 µL de sacarose 0,1 M (substrato para a invertase) e 100 µL de tampão acetato 100 mM pH 5, homogeneizando-os e, posteriormente, incubando-os por 10 minutos a 30ºC. O volume de amostra adicionado em cada tubo está descrito na Tabela 1.

Tabela 1. Volume de suspensão de Saccharomyces cerevisiae/tampão acetato 100 mM pH 5 utilizado para dosagem de atividade enzimática após o rompimento celular em moinho de bolas e permeabilização celular, seguido de precipitação com solvente orgânico.

Amostra	Volume de amostra/tampão
Branco	25 µL de tampão
Extrato celular - permeabilização	25 µL de amostra
Extrato celular - moinho de bolas	25 µL de amostra
Sobrenadante 1*	19 µL de amostra / 6 µL de tampão
Pellet 1*	19 µL de amostra / 6 µL de tampão
Sobrenadante 2*	15 µL de amostra / 10 µL de tampão
Pellet 2*	15 µL de amostra / 10 µL de tampão

* referente ao rompimento celular através do moinho de bolas.

        Incubou-se todos os tubos a 30ºC por 30 minutos, adicionando, em seguida, 250 µL do reagente DNS e incubando-os novamente a 100ºC por 5 minutos. Resfriou-os em um recipiente com água a temperatura ambiente e adicionou-se a cada um deles 2 mL de água destilada, agitando-os. Realizou-se a leitura da absorbância referente à cada amostra a 540 nm.