Anexo B2 EuroImmun Protocolo para Sarampo IgM (Inglês)

Anexo B2 EuroImmun protocolo para sarampo IgM (Inglês)        

EuroImmun Sarampo IgM ELISA v6

1. Propósito

Este documento estabelece os procedimentos para a realização de um  IgM ELISA de sarampo utilizando o kit de teste comercial Euroimmun Sarampo IgM ELISA. Este assalão é usado para a detecção de antibodies IgM específicos do sarampo no soro do paciente.  A detecção de anticorpos IgM específicos em uma amostra de soro coletada nos primeiros dias após o início da erupção cutânea pode fornecer evidências presuntivas de uma infecção atual ou recente  do vírus  do sarampo. O ponto de tempo ideal para a coleta de soro é três dias após o início dos sintomas (febre e erupção cutânea) quando >90% dos casos serão IgM positivos.  Os níveis de anticorpos IgM atingem o pico após cerca de 7-10 dias e depois diminuem rapidamente. Portanto, se o soro coletado menos de três dias após o início for negativo, uma segunda amostra seria necessária para confirmar/descartar o sarampo.

Quando um paciente com suspeita de sarampo foi recentemente vacinado (6-45 dias antes da coleta de sangue), o IgM não pode distinguir a doença do sarampo da resposta à vacinação.  A determinação do genótipo do sarampo é necessária quando os sintomas do sarampo ocorrem após a exposição ao vírus do tipo selvagem e o sarampo contendo vacina tem sido fornecido como profilaxia pós-exposição.

1. Princípio de Antecedentes e Testes

O vírus do sarampo é um patógeno humano pertencente à  família Paramyxoviridae de vírus RNA.  O vírus é transmitido por secreções respiratórias e causa doença aguda caracterizada por erupção cutânea e febre.  Para detectar anticorpos IgM de sarampo em uma amostra de poços de microtênio são revestidos com antígeno do sarampo.  A  amostra de soro é adicionada ao poço e quaisquer anticorpos específicos para o antígeno presente se ligarão ao antígeno ligado. Após a remoção de material desvinculado, anticorpos IgM reativos de sarampo nas amostras podem ser detectados usando um IgM anti-humano  comercial que é conjugado a uma enzima.  Após a lavagem para remover o conjugado sem limites, um cromagênio/substrato é adicionado.  Isso reage com o conjugado para produzir uma mudança de cor.  A intensidade da cor pode ser quantificada fotometricamente e é proporcional ao nível de anticorpo IgM ligado.

1.  Documentos relacionados

• Euroimmun IgM Resultados Planilha de Resultados QC
• Auxílio ao emprego euroimune

1. Equipamento

•  Leitor de Microplacência absorvente
• Vórtice
• Lavador de microplaco automatizado (opcional)
• Freezer -20ºC
• Geladeira, 4ºC

1. Reagentes e Mídia

• Controle de soro positivo interno
• Controle de soro negativo interno
• Euroimmun Sarampo IgM Kit (Catálogo # EI 2610-9601-4 M para 96 testes)

• Tiras de teste de microtíter (STRIPS)
• Soro de controle positivo (pronto para usar, CONTROLE DE POS)
• Soro de controle negativo (pronto para usar, CONTROLE NEG)
• Calibrador (pronto para usar, CAL)
• Conjugado enzimático (pronto para uso, CONJUGATE)
• Solução de lavagem (WASH BUFFER 10X)
• Tampão de amostra (pronto para usar, BUFFER DE AMOSTRA)
• Solução de parada (pronta para uso, SOLUÇÃO STOP)
• Cromogênio/Substrato (pronto para uso, SUBSTRATE)
• Certificado de controle de qualidade

1. Suprimentos, Outros Materiais

• EPI (jaleco, luva, óculos)
• O teste será
• Água destilada ou  desionizada
• Tubos de microcentrifuuagem, tubos de titer ou placas de poços profundos
• Squeeze bottle (se não estiver usando arruela automatizada)

•Micropipetters 1-20μl, 20-200μl e 200-1000μl        

• Pipetter multicanal 50-300μl ou 20-200 μl (opcional)
• Dicas de pipeta
• Pipetas sorológicas 5ml, 10ml, 25ml
• Pipeta ajuda
• Termômetro para temperatura ambiente
• Toalhas de papel
• Reservatórios de reagentes
• Contêiner para descartar resíduos
• Solução de alvejante 10%
• Fita

1. Precauções de segurança

• Siga as precauções universais enquanto trabalha com sangue e/ou produtos sanguíneos.
• Lave as mãos antes e depois de manusear os reagentes. A contaminação cruzada de reagentes e/ou amostras pode causar resultados errôneos.
• Nunca pipeta pela boca ou permitir que reagentes ou amostra de paciente entrem em contato com a pele.
• Manuseie todo o sangue e soro como se fosse capaz de transmitir doenças.

1. Informações da amostra / Processamento

• Armazenar soro entre 2-8ºC se os testes ocorrerem dentro de 1 semana. Se os espécimes forem mantidos por períodos mais longos, armazene a -20ºC ou mais frio.
• Não use um freezer sem geada porque pode fazer com  que as amostras passem por ciclos de congelamento e possam degradar o anticorpo.
• Amostras armazenadas incorretamente podem produzir resultados errados.
• Obviamente, as amostras contaminadas não devem ser testadas devido ao risco de resultados incorretos.
• Se a sera emparelhada for coletada, as amostras agudas devem ser coletadas o mais rápido possível após o início dos sintomas. A segunda amostra deve ser coletada de 14 a 21 dias após a coleta da amostra aguda.  Ambas as amostras devem ser executadas na mesma placa.

1. Controle de Qualidade

• Use apenas água destilada ou desionizada e vidros limpos.
• Prepare as diluições de trabalho dos reagentes de ensaio da mesma forma para cada corrida.
• Observe estritamente os tempos e temperaturas de incubação.
• Combine os identificadores do paciente com tubos de diluição do soro e localização de soro em placas de ensaio com  valores calculados de densidade óptica (OD).
• Um registro deve ser mantido de cada ensaio à medida que o teste é realizado. Observe os reagentes, números de lote e datas de validade.  Registo como as diluições são feitas e o tempo de cada etapa.
• Registo e monitore valores de controle para controles de soros positivos e negativos internos, a fim de rever o desempenho do ensaio ao longo do tempo.
• Não utilize kits após a data de validade marcada no kit ter sido atingida.

1. Controles

• Inclua um calibrador, controle positivo e controle negativo em cada corrida.
• Executar controles de sera positivos e negativos em cada corrida, além dos controles que estão incluídos no kit. Armazenar controles de sera interna a - 20ºC.  Traçar os resultados de controles internos ao longo do tempo para acompanhar as tendências.

1.  Valores Aceitos

• O OD do calibrador deve estar na faixa dada no certificado de controle de qualidade
• A relação de controle positiva deve estar dentro do intervalo dado no certificado de controle de qualidade
• A relação de controle negativo deve estar dentro do intervalo dado no certificado de controle de qualidade
• Se os controles forem executados em duplicação, a média das duas leituras deve ser usada para determinar o valor do calibrador e as razões dos controles positivo e negativo

1. Repita o ensaio se os requisitos de controle de qualidade não forem atendidos. Se o ensaio falhar qc novamente no novo teste, discuta o próximo curso de ação com o supervisor.

1. Procedimento de teste (consulte a inserção do kit)

• Leve todos os reagentes à temperatura ambiente (18-25ºC).  Use um termômetro calibrado para verificar se a temperatura ambiente está dentro da faixa especificada.  

• Prepare o layout da placa na planilha de resultados euroimmun IgM e Job Aid. Calcule o número de poços necessários para o ensaio, incluindo controles calibradores, positivos, negativos e internos (IHC).

• Usando a seção cinza na planilha, determine a quantidade de estoque de trabalho Tampão de lavagem necessário e a quantidade de lavagem concentrada e água destilada necessária para fazer uma diluição de 1:10.

• Controles e amostras de vórtice antes do uso.

• Dispense 1000 μl de tampão de amostra em tubos micro/titer ou placa de poço profundo, uma para cada amostra a ser testada, incluindo controles internos (IHC).

• As amostras devem ser diluídas antes do uso.  Os três controles do kit estão prontos para uso — NÃO DILUIR.

• Amostras de teste diluídos 1:101 com o  buffer amostral, certificando-se de alternar dicas entre cada amostra.  (ou seja: adicione 10 μ l de amostra a 1000 μl de tampão de amostra) Misture bem usando um vórtice ou insurgindo repetidamente para cima e para baixo pelo menos 10 vezes.  Não aerossolize.

• Incubar as amostras de teste  diluídas por 10 minutos à temperatura ambiente (18-25ºC) antes de adicionar aos poços.

• Diluir o concentrado tampão de lavagem 10X com água destilada seguindo os cálculos na planilha euroimune.   (por exemplo: se correr 4 tiras, adicione 20 ml de lavagem buffer a 180 ml de água destilada) O buffer pode ser armazenado por até 28 dias a 2-8°C.  Se estiver usando tampão refrigerado, leve à temperatura ambiente antes de prosseguir.

• Open o saco contendo as  tiras de microteste e remova quaisquer  tiras não precisadas da moldura.  Grave as tiras de teste restantes no quadro para evitar que elas ejetem durante os processos de lavagem.  Substitua as tiras extras e o dessecante no saco e resseque-se cuidadosamente.  Volte para a geladeira.

• Adicione 100 μ l de amostras diluídas e controles nos poços apropriados, alterando dicas para cada amostra, da seguinte forma:

• Bem         A1calibrator

• Bem B1positive controle

• Bem         C1negative control

• Bem         D1in-house soro de controle positivo (IHC)

• Bem, soro de controle negativo da E1in-house (IHC)

• Bem F1patient (teste) soro        

• Bem G1patient         (teste) soro

• Bem         H1patient (teste) soro

• Incubar a placa de teste por 30 minutos no temperature da sala (18-25ºC)
• Após a incubação é completa lavar todos os poços com solução de lavagem diluída da seguinte forma:

• Aspirar ou sacudir a solução de incubação; mancha em uma toalha de papel
• Encha cada poço com solução de lavagem de 300 μl (450 μl se usar arruela automatizada)
• Deixe o tampão de lavagem nos poços por 30-60 segundos
• Aspirar ou sacudir a solução de lavagem
• Repita o procedimento de lavagem mais 2 vezes (total 3)
• Borrida qualquer líquido restante em uma toalha de papel
• A remoção completa da última lavagem é fundamental para o desempenho preciso do teste

• Adicione 100 μl de conjugado a cada poço (incluindo poços de controle de kit) incubar o anúncio por 30 minutos à temperatura ambiente (18-25ºC).
• Lave três vezes como descrito acima.
• Adicione 100 μl de  solução de Cromogênio/substrato a cada poço, incluindo os controles do  kit  e incubar por 15 minutos à temperatura ambiente (18-25ºC).  Proteja a placa e o reagente da luz.
• Adicione 100 μl de solução de parada a cada poço.
• Se o leitor de placa não tiver a capacidade de agitar, agite suavemente a microplacão para garantir uma distribuição homogênea da solução tocando na lateral do quadro algumas vezes, tendo certeza de não derramar ou aerossolizar o líquido.
• Leia a densidade óptica dentro de 30 minutes de adicionar solução stop. Leia em 450 nm, comprimento de onda de referência entre 620 nm e 650 nm (por exemplo, 630 nm).

1. Cálculos Manuais

• A planilha de validação manual euroimune  pode ser usada para calcular manualmente os resultados.
• Preencha a parte superior da planilha com informações pertinentes.
• Digite os valores de OD brutos na coluna B.
• Determine a proporção de todos os controles de kit e internação dividindo o OD bruto com o OD bruto do calibrador.
• Determine a validade do ensaio respondendo às perguntas listadas.  Se essa seção indicar todos os dados pass, o ensaio é válido e os resultados podem ser reportados.
• Determine todas as proporções de amostra.
• Com base no valor da razão determinada, um resultado qualitativo pode ser determinado e enterado na coluna Interpretação como positivo, limítrofe ou negativo, conforme descrito na tabela da seção 12.

O valor da razão The para os controles positivos e negativos e para cada amostra é determinado dividindo o valor de OD da amostra pelo calibrador de corte OD.

Por exemplo:

• OD obtido para o calibrador= 0,325
• OD obtido para soro do paciente= 0,60
• Valor da razão= 0,60/0,325 = 1.846                

1. Cálculos Eletrônicos

• A planilha de resultados euroimmun IgM pode ser usada para preparar o layout da placa, bem como calcular resultados.
• Preencha a parte superior da planilha com informações pertinentes.
• Utilizando o Certificado de Controle de Qualidade do kit, preencha o valor de intervalo para o calibrador, faixa válida de controle positivo, faixa válida de controle negativo.
• Na parte inferior da página há um modelo para preparar o layout da placa.
• Usando essas informações, determine o número total de poços que estão sendo usados na placa.  Insira esses dados no poço indicado para essas informações na  célula para o uso de uma arruela de placa ou da célula se lavar manualmente.
• As informações contidas na caixa cinza calcularão automaticamente a quantidade de buffer wash para processar o número de amostras na placa.
• Uma vez obtidos valores de OD brutos, insira-os na seção inferior indicada para valores de OD brutos.
• Determine a validade do ensaio verificando as informações contidas na caixa vermelha sob Controle de Qualidade.  Se essa seção indicar todos os dados pass, o ensaio é válido e os resultados podem ser reportados.
• A coluna Proporção calcula automaticamente a razão com base no valor de OD e no valor do calibrador conforme descrito abaixo.
• Com base no valor da razão determinada, aparece um resultado qualitativo na coluna Resultado como positivo (Pos), borderline (B) ou negativo (Neg) conforme descrito na tabela na seção 12.

1. Interpretação

Relação	Resultado	Interpretação
<0.80	Negativo	Nenhum nível detectável significativo de anticorpo IgM de sarampo
≥0,8 para <1.1	Fronteira	A amostra deve ser retestada.
≥1.10	Positivo	Nível significativo de anticorpo IgM de sarampo detectável.  Indicativo de infecção atual ou recente.

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