EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA UREASE DE SOJA

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DISCIPLINA: BIOQUÍMICA MOLECULAR

DOCENTE: FRANCISCA MARTA MACHADO CASADO DE ARAÚJO

DISCENTE: SÍLVIA ZILMARA MAIA

                         

AULA PRÁTICA 04 – EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA UREASE DE SOJA

MOSSORÓ

2016

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1. Fundamentação Teórica:

As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas. Os catalisadores aceleram essas reações baixando a energia de ativação necessária para que as mesmas ocorram. Praticamente todas as reações que caracterizam o metabolismo celular são catalisadas por enzimas, sendo assim, consideradas as unidades funcionais do metabolismo celular. Para que a enzima se transforme em complexo ativado, o substrato deve estar em alta concentração. Os fatores que influenciam a atividade enzimática são: concentração do substrato, temperatura, pH, concentração de ativadores e inibidores, concentração do produto.

A urease está presente em algumas bactérias e plantas. Esta enzima pode ser extraída com facilidade da soja. A urease é uma enzima que catalisa a hidrólise da ureia em amônia e dióxido de carbono:

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Em meio aquoso:

2NH3 + 2H2O → 2NH4OH (hidróxido de amônio)

CO2 + H2O → H2CO3 (ácido carbônico)

H2CO3 + 2NH4OH → (NH4)2CO3 + 2H2O (carbonato de amônio).

1. Objetivos:

• Demonstrar a natureza proteica das enzimas;
• Determinar qualitativamente a atividade enzimática, usando urease como exemplo;
• Exemplificar desnaturação (inativação) enzimática;
• Demonstrar a especificidade da ação enzimática.

1. Materiais e Reagentes:

• Solução de uréase;
• Tampão fosfato 0,001M, pH 7,0;
• Tampão fosfato 0,001M, pH 7,0 contendo 1% de ureia;
• Tampão fosfato 0,001M, pH 7,0 contendo 1% de tioureia;
• Solução de vermelho de fenol.

1. Metodologia:

1. Extração:

Foi pesado cerca de 15g de farinha de soja e foi colocado em um erlenmeyeer de 250mL. Adicionou-se 100mL de glicerol a 75%. Arrolhou-o e agitou-o a suspensão com a mão, por 15 minutos. Colocou-se no refrigerador até o momento da aula. O extrato glicerinado foi filtrado através de gaze, espremendo levemente com as mãos. Foi acondicionado em um frasco de vidro.

1. Primeiro teste: Atividade da enzima:

Neste teste foi utilizado o indicador vermelho de fenol que é um cristal vermelho estável ao ar, usado como um indicador de pH, que tem zona de transição a 18ºC, pH entre 6,4 - 8,0 e a 100ºC, pH entre 6,6 - 8,2, onde sua cor muda gradualmente do amarelo ao vermelho. Dependendo da concentração do indicador e da temperatura, o intervalo de mudança pode variar. Observou-se a atividade enzimática na presença de solução tampão com e sem ureia.

Preparo das soluções:

Tubo A:

• Foi adicionado 3mL de tampão com 1% de ureia;
• 1 gota do indicador vermelho de fenol;
• 4 gotas de uréase.

Tubo B:

• Foi adicionado 3mL do tampão fosfato;
• 1 gota do indicador vermelho de fenol;
• 4 gotas da enzima (uréase).

Após ser feita a mistura aguardou-se 5 minutos para observar-se a mudança de coloração. No tubo A, observou-se que quando a enzima está ativa ocorre liberação de amônia em quantidades suficientes para solução tampão tornar o meio da reação alcalino. Como consequência da subida do pH, a solução muda de cor chegando ao tom rosado; Já no tubo B que não apresenta a presença do substrato não houve reação, chegando a coloração amarelada.

1. Segundo teste: Desnaturação da enzima pelo calor.

As enzimas possuem uma estrutura tridimensional bem definida e sensível ao efeito do calor, podendo causar a perda de sua estrutura (secundária e/ou terciária), a temperatura aumenta a energia vibracional e rotacional nas ligações, pontes de hidrogênio são quebradas modificando sua estrutura. Esse fenômeno é chamado de desnaturação que afeta as estruturas quaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar sua estrutura primária, mudando sua função e causando danos irreversíveis.

Em um tubo de ensaio foi colocado 2mL de água destilada e 4gotas de uréase. Agitou-se e foi fervido durante 10 minutos. Logo após foi preparado o tubo C.

Preparo das soluções:

Tubo C:

• Foi adicionado 3mL de tampão com 1% ureia;
• 1 gota do indicador vermelho de fenol;
• 4 gotas de uréase fervida.

Foi misturado e aguardamos 5 minutos para que pudéssemos observar as mudanças de coloração. Após o tempo determinado foi observado que não houve reação catalítica pelo fato de que a enzima foi desnaturada após a fervura, portanto, permaneceu na coloração amarelada.

1. Terceiro teste: Especificidade da enzima.

A especificidade das enzimas depende da região chamada de sitio ativo, lugar responsável pela ligação com o substrato. A urease possui um grau de especificidade alto para a ureia. Isto pode ser provado com uma reação entre a enzima e o composto que possui uma estrutura semelhante à do substrato, a tiouréia, verificando a mudança de coloração.