Efeito da Temperatura na Atividade Catalítica

                           Universidade Estadual de Campinas [pic 1][pic 2][pic 3]

                Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA)        

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Efeito da temperatura na atividade catalítica de enzimas

2019

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1. Introdução

        As enzimas são catalisadores biológicos, versáteis, que apresentam várias propriedades que as tornam atrativas em processos onde ocorram biotransformações ( SPIER, 2005). Sua ampla aplicação na indústria é devido à alta atividade catalítica em comparação com os catalisadores convencionais, por atuarem com alta eficiência em condições reacionais amenas ( SPIER, 2005). As enzimas podem ser encontradas em células de tecidos animais e vegetais bem como em microrganismos, sendo que nestas últimas tornam-se uma opção particularmente atrativa, devido a razões como ampla disponibilidade, custo de produção relativamente baixo, condições suaves de síntese, ampla especificidade pelo substrato, diferentes características físico-químicas e suscetibilidade de manipulação genética (SPIER, 2005).

As amilases estão entre os grupos mais importantes sob o ponto de vista biotecnológico, cujas aplicações crescem significativamente, como por exemplo, a α-amilase é uma enzima que cliva as ligações α-1,4 do amido liberando unidades de glicose e dextrinas (SPIER,2005).

As amilases fúngicas, que são carboidrases pertencem à classe das hidrolases, que são responsáveis por reações hidrolíticas (HARGER, 1982). A maioria das carboidrases é produzida por diferentes tipos de fungos e muitas espécies produzem diferentes carboidrases (CARVALHO, 2007).

Para a atividade da α-amilase é necessária a presença de Ca+2 como cofator, dado que as amilases de origem diferentes se diferenciam pela força de ligação com o cálcio, que não influi somente na atividade da enzima como também aumenta sua estabilidade frente a trocas de temperatura e de pH (SPIER, 2005).

A α-amilase fúngica diminui sua atividade rapidamente acima de 50ºC, mas na presença de um excesso de íons cálcio a desativação pode ser diminuída (SPIER, 2005).. Íons de metais pesados, como o mercúrio, a prata e o chumbo inibem a α-amilase (HARGER, 1982).

Para utilização na indústria, a α-amilase fúngica é utilizada geralmente para a suplementação da atividade diastásica em produtos panificados, seja para correção ou suplementação em farinhas de trigo.

1. Materiais e métodos

2.1. Materiais

20 µL α-amilase fúngica comercial em 250 mL de água destilada ;

Solução de Amido pH 6,0, da qual o substrato foi preparado previamente pela mistura de solução de amido (1%m:v) em água destilada previamente aquecida durante 5 minutos em ebulição e resfriada à temperatura ambiente;

Tampão fosfato 0,1 Mol/L pH 6,0: água destilada, na proporção 5:1:2 (v:v);

 Solução de Iodo - KI (0,3 % I2 + 3% KI em água destilada);

 Solução HCl 0,1 Mol/L.

2.2 Métodos

Pipetou-se 0,2 mL da solução de α-amilase fúngica em tubos de ensaio, diretamente no fundo dos tubos, dos quais foram incubados nas temperaturas de 5ºC, 30ºC, 50ºC, 60ºC   e 80ºC durante 15 minutos. Posteriormente, resfriaram-se os tubos de ensaio em béquer com água na temperatura ambiente.

        Adicionou-se 0,8 mL de substrato amido (Previamente incubado a 50°C) em cada um dos 7 tubos de ensaio contendo 0,2 mL da solução de enzima previamente tratada a diferentes temperaturas. Os tubos foram agitados durante 5 minutos  tubos para que ocorresse a homogeneização.

Após a incubação, paralizou-se  a reação adicionando 0,5 mL de HCl 0,1 Mol/L em cada tubo de ensaio, agitando os tubos para homogeneização a mistura reacional.

 Adicionou-se exatamente 0,1 mL de solução de Iodo - KI nos tubos de ensaio e completou-se o volume da solução para 15 mL com água destilada. Os tubos foram tampados com filme plástico e misturados por inversão.

 Preparou-se o Tubo “branco”, onde foi pipetado 0,1mL de solução de Iodo-KI + 14,9 mL de água destilada em tubo de ensaio.

 Preparou-se o Tubo “controle”, onde foi pipetar 0,8 mL substrato + 0,5 mLHCl 0,1 Mol/L + 0,1 mL de solução Iodo KI, em tubo de ensaio.

Em seguida adicionaram-se 13,6 mL de água destilada no tubo controle, para completar o volume para 15 mL.

 Calibrou-se o espectrofotômetro com a solução do Tubo “branco” de modo a medir a absorbância das amostras dos tubos teste e da solução do Tubo “controle” a 620 nm.

1. Resultados e discussão

Através do espectrofotômetro foi obtido o valor de absorbância das amostras em diferentes temperaturas. Através dos valores obtidos, foram calculados as unidades de atividade enzimática de α- amilase (em U/mL de enzima), como mostrado no exemplo a seguir para a temperatura de 5 °C:

• Determinação de unidades de atividade enzimática total (em U)

Calculada a partir da diferença entre o valor da absorbância do tubo de controle e a absorbância da amostra (Tabela 1):

Abs: 0,821 - 0,801

Abs: 0,020

        Cada 1U equivale a 0,001 abs, obtendo-se o valor de unidades de atividade enzimática em 0,020:

1U - 0,001 abs

x - 0,020 abs

x = 20U

• Determinação de unidades de atividade enzimática por mL de enzima comercial (U/mL*min)

        E obtida a partir do tempo de reação de 1 minuto:

20U - 5 min

y     - 1 min

y = 4 U/min

        Como foi utilizado 0,5 mL de enzima comercial, o valor encontrado anteriormente deve ser ajustado para 1 mL de enzima comercial:

4 U/min - 0,5 mL

z  -  1   mL

z - 8 U/min*mL

        A enzima comercial estava em uma concentração de 20 μL /250 mL, que equivale a 0,02 mL/ 250 mL, multiplicando-se a fração por 50 no numerador e denominador, obtemos a proporção 1:12500, sendo o 12500 o fator de diluição, que deve ser multiplicado pelo resultado obtido. O valor final é de 100000 U/min*mL

• Determinação de atividade relativa (em %)

Considerando o valor máximo obtido de unidades de atividade enzimática de 4005000  U/min*mL (Tabela 1), a atividade relativa é obtida dividindo-se o valor de 100000 por 4005000 e multiplicando por 100: