Os Fundamentos da Engenharia Bioquímica

Fundamentos da Engenharia Bioquímica I - Desafio Contextualizado

CRISPR E A SAÚDE HUMANA

As bactérias constituem a vasta maioria da biomassa da Terra e, não surpreendentemente, existe um número muito maior de vírus que infectam bactérias do que vírus de animais e plantas, e esses vírus geralmente possuem genomas de DNA. Uma descoberta recente revelou que muitas espécies de bactérias, e praticamente todas as espécies de arqueobactérias, usam um repositório de pequenas moléculas de RNA não codificadoras para procurar e destruir o DNA de vírus invasores. Esse mecanismo de defesa é conhecido como sistema imunológico adaptativo microbiano CRISPR. 

Quando bactérias e arqueias são infectadas pela primeira vez por um vírus, elas apresentam um mecanismo que faz pequenos fragmentos desse DNA viral, que são integrados em regiões especiais do genoma bacteriano conhecidas como lócus CRISPR (pequenas repetições palindrômicas regularmente intercaladas e agrupadas, do inglês clustered regularly interspersed short palindromic repeat). Cada lócus, portanto, porta uma memória temporal de infecções prévias, funcionando com o mesmo propósito de uma vacina. Esse aspecto do sistema CRISPR é similar, em princípio, à imunidade adaptativa em mamíferos, no sentido de que as células portam uma memória de exposições passadas que são usadas para proteger contra exposições futuras. Além disso, em diferentes espécies de bactérias e arqueobactérias, os crRNAs são processados de diferentes formas, e em alguns casos, os crRNAs podem atacar RNAs virais assim como DNAs (Alberts et al., 2007).

Nos últimos anos foram desenvolvidas uma série de tecnologias de edição de genoma baseadas em nucleases programáveis. Da geração atual de tecnologias de edição de genoma, a que se desenvolve mais rapidamente é a classe de endonucleases guiadas por RNA conhecidas como Cas-9 do sistema CRISPR, que podem ser facilmente direcionadas a praticamente qualquer localização genômica de escolha por um breve RNA guia. 

A sequência guia dentro desses RNAs CRISPR (crRNA) normalmente corresponde a sequências de fago, constituindo o mecanismo natural para a defesa antiviral CRISPR, mas pode ser facilmente substituída por uma sequência de interesse para redirecionar a nuclease Cas-9. A facilidade de direcionamento da Cas-9 e a sua alta eficiência como uma nuclease específica de local abriram uma ampla gama de aplicações biológicas em pesquisa básica para biotecnologia e medicina, como o uso desses sistemas ​​para modificar os genomas de bactérias probióticas ou associadas ao microbioma, leveduras e bacteriófagos, além de, também poderem ser usados ​​para matar cepas específicas com base em sua sequência, sem tocar o resto do microbioma (Hsu, Lander and Zhang, 2014; Ramachandran and Bikard, 2019).

Um problema central na microbiologia e no controle de doenças infecciosas é a falta de ferramentas para alterar a composição das comunidades microbianas ou para controlar espécies patogênicas. As nucleases baseadas em CRISPR podem ser facilmente reaproveitadas como agentes antimicrobianos específicos de sequência, mas o desenvolvimento de um sistema de entrega robusto e amplamente aplicável continua sendo um obstáculo a ser vencido.

A regulação seletiva de bactérias em populações microbianas complexas é a chave para o controle de bactérias patogênicas. No entanto, um problema central é a falta de ferramentas específicas para controlar seletivamente as espécies patogênicas ou, de outra forma, alterar a composição do microbioma humano e outras comunidades microbianas. Os métodos tradicionais, como o tratamento com antibióticos, sofrem de uma série de limitações que impedem o controle seletivo de maneira definida e eficiente, e estão se tornando menos eficazes devido ao seu uso excessivo e ao desenvolvimento de bactérias multirresistentes. E a terapia baseada em fagos é limitada pela variedade de hospedeiros e pelo rápido desenvolvimento de bactérias resistentes a fagos. Essas limitações destacam uma necessidade crescente de ferramentas eficazes e seletivas para a modulação direcionada de microbiomas.

Estudos publicados na Nature Communications mostraram que os plasmídeos conjugativos são um sistema eficiente para entregar nucleases CRISPR às bactérias. Os pesquisadores desenvolveram um sistema cis-conjugativo onde o plasmídeo codifica tanto a maquinaria conjugativa quanto a nuclease CRISPR, ao contrário das configurações trans previamente testadas onde a maquinaria conjugativa e a nuclease foram codificadas em moléculas de DNA separadas. As bactérias que recebem o plasmídeo cis-conjugativo tornaram-se doadoras em potencial para as rodadas subsequentes de conjugação, potencialmente levando a um aumento exponencial do número de bactérias doadoras conjugativas na população. Eles testaram o plasmídeo cis-conjugativo em um sistema de co-cultura de duas espécies, encontrando alta frequência de transferência conjugativa de plasmídeos de Escherichia coli para Salmonella enterica sob condições que aumentam o contato célula a célula. Os resultados destacaram a promessa de entrega conjugativa de nucleases CRISPR como uma ferramenta eficaz para a modificação de microbiomas (Hamilton et al., 2019).