Tecnicas de Biologia Molecular

Técnicas de biologia molecular

Enzimas de restrição, mapas de restrição e clonagem molecular

Toda técnica em que se trabalha com DNA, utiliza-se enzimas purificadas, que normalmente existem dentro das células. Elas são purificadas e são comercializadas e a partir disso podem-se usar as enzimas em um meio artificial, enzimas da replicação, do reparo, de degradação, são altamente purificadas e com isso são caras. A possibilidade de usar essas enzimas em um meio artificial foi crucial para os avanços da engenharia genética.

Quais são essas enzimas?

• Nucleases -  DNases e ribonucleases -  enzimas que degradam o DNA e o RNA quebrando as ligações fosfodiéster que unem os nucleotídeos.
• Ligases – Liga dois fragmentos de DNA, com a ligação fosfodiéster
• Polimerases – DNA e RNA polimerase e Taq polimerase (DNA polimerase que atua em altas temperaturas)
• Enzimas de modificação- removem ou adicionam grupos químicos ao DNA. Existem enzimas que removem ou adicionam o grupo fosfato na extremidade.
• Topo isomerases- aliviam a tensão no DNA. Ajudam no superespiralamento da molécula. Não tem muita função na engenharia genética.

Nucleases, vai falar das DNases:

Existem 2 tipos:

Exonucleases – cortam nas pontas da molécula de DNA, liberando nucleotídeos das pontas. Tipos de exonuclease:

• Remove nucleotídeos das 2 fitas, a partir da extremidade.
• Remove nucleotídeos somente a partir da extremidade 3’, de um lado e de outro, gera um pedaço de fita simples de um lado e um pedaço do outro.

Endonucleases – cortam no meio da molécula de DNA, liberando fragmentos de DNA menores. 3 tipos importantes:

• Clivam somente fita simples. Em DNA de fita simples ou em DNA em que tem um pedaço de fita simples.
• Conseguem clivar fita simples e dupla. São consideradas inespecíficas e atacam o DNA em qualquer ligação fosfodiéster interna. Em uma reação que ocorre ao longo de algumas horas será encontrada uma mistura de fragmentos menores, oligonucleotídeos na reação.
• Endonucleases de restrição (mais importante na engenharia genética) clivam no meio do DNA somente em sítios específicos. Cada enzima cliva em um sítio específico, com sequência específica.

Endonucleases de restrição – permite que a clivagem torne o DNA bem reprodutível, pois ela sempre cliva no mesmo sítio.

Em 78 conseguiram purificar várias enzimas de restrição. As enzimas de restrição foram percebidas observando que algumas linhagens de bactérias eram resistentes a certos vírus, essa resistência foi chamada de restrição controlada pelo hospedeiro. Somente 20 anos depois descobriram o mecanismo de defesa que essa célula tinha contra o bacteriófago. O que se sabia era que a bactéria era infectada com o vírus e ele injetava o DNA na célula hospedeira para produzir novas partículas virais e essas bactérias não morriam, pois elas degradavam o DNA viral, mas não o DNA da própria bactéria. Essas bactérias produziam as enzimas de restrição que reconheciam sítios específicos do DNA viral. Se no DNA da célula também tiver a sequência as enzimas diferenciam, pois elas também tem função de metilação. Nos sítios do DNA bacteriano em que ela reconhece como sitio de clivagem ela coloca o grupo metil em alguma base desse sítio, quando o DNA viral entra na célula ela reconhece o sítio que não está com grupo metil e o degrada. No DNA bacteriano o grupo metil serve como sinal para que as enzimas de restrição não o degradem.

Toda bactéria que existe produz enzima de restrição

Atualmente existem mais de 1200 tipos de enzimas de restrição purificadas e disponíveis comercialmente. Essas enzimas reconhecem e clivam o DNA em sequências específicas. Essas sequencias são chamadas de sítios de restrição e geram conjuntos de fragmentos menores.

De todas as endonucleases de restrição tem 3 tipos e as mais usadas em engenharia genética são as do tipo 2 que são mais precisas no corte.

As do tipo I reconhecem o sítio e vão clivar uns 1025 pares de bases depois – não são muito específicas no corte.

As do tipo II clivam exatamente no sítio de reconhecimento – muito precisa e a usada para as manipulações com o DNA em engenharia genética.

As do tipo III reconhecem o sítio e vão clivar um pouco antes ou um pouco depois do sítio de restrição, é mais próximo mas não muito específica.

As enzimas do tipo I e III não dão a possibilidade de saber onde o DNA foi cortado.

As sequências de reconhecimento são sequências que as enzimas de restrição vão conseguir quebrar e o restante do DNA elas não clivam. Essas enzimas são tão específicas que diferentes enzimas, mesmo que elas venham do mesmo organismo, elas vão reconhecer diferentes sequências.

Enzimas de Proteusvulgaris reconhecem sequências diferentes mesmo sendo do mesmo organismo.

Outra coisa importante para essas sequências são que sequências de restrição são sequências palindrômicas, que são distribuídas no DNA, as fitas da sequência de restrição quando lidas do sentido 5’-3’ são iguais. No slide em uma fita: GAATTC e na outra GAATTC. Normalmente essas sequências são curtas de 4 a 8 nucleotídeos, geralmente são 4 e 6.

Existem as enzimas de restrição que tem as sequências de reconhecimento degeneradas. No meio da sequência pode ter qualquer base, N, só no começo e final da sequência as bases não devem alterar e as enzimas reconhecem. Essas sequências não serão palindrômicas.Por exemplo a enzima himf I.

Tem uma tabela no cap9 do lehninguer, que mostra alguns sítios de restrição para algumas enzimas importantes. De um lado tem a enzima e do outro o sítio de restrição.

A nomenclatura dessas enzimas de restrição é a abreviação de qual microorganismo a produziu. A enzima chama Eco. vem de E. coli, RX é da linhagem que ela foi tirada e o número é da ordem em que ela foi descoberta nesse mO.

        Como funciona a hidrólise enzimática? O alvo da enzima é a ligação fosfodiéster onde ela quebra, toda enzima que tem alvo a ligação fosfodiéster precisa de magnésio para estabilizar o complexo intermediário seja de formação ou de quebra. Para as enzimas de restrição esse magnésio pode ser substituído por manganês ou cátion divalente, mas o ideal é o magnésio. Ocorre a hidrólise gerando uma extremidade 3’OH e uma 5’fosfato.