COLORAÇÃO DE GRAM

Introdução

A técnica da caloração de Gram é o método tintorial predominante em microscopia na identificação de tipos de bactérias, e tem a finalidade de estudar as propriedades ou diferenciar estes microorganismos em grupos específicos para fins taxionômicos e de diagnóstico. Desenvolvida, pelo médico dinamarquês Christian Joaquim Gram o qual em 1884 observou que as bactérias quando tratadas com diferentes corantes, adquiriam cores distintas, sendo as que ficavam roxas foram chamadas de gram positivas e as que ficavam rosadas chamadas de gram negativa.

Esta diferenciação baseia-se na diferente estrutura e composição, nomeadamente no diferente teor de lipídeos, da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas.A parede celular das bactérias Gram positivas é constituída principalmente por uma camada grossa de peptidoglicana e o seu teor em lipídeos é muito baixo. A camada de peptidoglicana atua, assim, como uma barreira impedindo a saída do corante primário e estas células ficam coradas de violeta. A parede celular das bactérias Gram negativas tem um teor em lipídeos elevado na sua membrana externa, para além de uma camada fina de peptidoglicana que circunda a membrana plasmática. Em conseqüência, durante o passo de diferenciação pelo álcool, parte dos lipídeos é dissolvida pelo álcool, formando-se poros na parede por onde o corante primário (cristal violeta) sai das células. Estas células ficam transparentes após o passo de diferenciação pelo álcool, sendo posteriormente coradas com o corante secundário (safranina).

Objetivo

Executar a técnica de coloração de Gram, Identificar os principais tipos morfológicos das bactérias, citando as formas e arranjos das bactérias e classificar as bactérias de acordo com a coloração de Gram e discutir a importância do método na identificação de microrganismos

Materiais

• culturas de bactérias do corrimão da escada do IFRJ;

• amostra de Escherichia Coli inoculadas em meio inclinado;

• amostra de Microcócos Luteus inoculadas em meio inclinado;

• amostra de Candida inoculadas em meio inclinado

• lâminas de vidro;

• cristal violeta;

• lugol;

• etanol 95%;

• safranina;

• água destilada;

• óleo de imersão;

• alças de inoculação;

• bico de bunsen;

• alcool-acetona;

• Microscópios ópticos.

Metodologia

1. Fez-se a assepsia da bancada com alto 70% e um papel;

2. Dentro da zona de segurança;

3. Colocou-se uma pequena gota de água sobre uma lâmina;

4. Flambou-se a alça de platina e retirar uma pequena porção do crescimento bacteriano. Colocou-se a porção sobre a gota de água e espalhar obtendo assim o esfregaço. Deixou-se secar espontaneamente;

5. Fixou-se o esfregaço à lâmina, segurando-a com um pregador de madeira e passando-a três vezes sobre a chama do bico de Bunsen com a parte do esfregaço para cima;

6. Colocou-se sobre o esfregaço aderido à lâmina a solução de cristal violeta durante 1 minuto;

7. Lavou-se ligeiramente com água e deixar escorrer;

8. Cobriu-se o esfregaço com lugol durante 1 minuto e 30 segundos;

9. Inclinou-se